化学的手法による標的分子の迅速同定とリガンド結合部位の高精度解析一般法の確立

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12470483
• 研究機関: 熊本大学
• 研究代表者: 中山 仁 熊本大学, 薬学部, 教授 (70088863)
• 研究分担者: 國安 明彦 熊本大学, 薬学部, 助教授 (90241348) ; 益田 勝吉 サントリー生物有機科学研究所, 研究員 (30190359)
• キーワード: 光アフィニティラベル / 抗リガンド抗体 / TDF-MS / ESI-MS / MS / ラベル化ペプチド解析 / 結合部位の同定

研究概要

光アフィニティラベル(PAL)法は薬物や生理活性物質の標的となる高分子の同定と結合構造の詳細を明らかにできる優れた方法であるにもかかわらず、従来、それほど広範には利用されていない最大の理由は、ラベルペプチドの特異的回収とこれを高感度・高精度に検出する分析手法が確立していなかったためである。本研究では、この手法を普遍化する必要条件を確立することを目的とし、3年間で取り組んだ。得られた成果は以下の通りである。
(1)光アフィニティラペル用試薬(TOY-SG)と類似構造をもつグルタチオン誘導体をハプテンとした抗体を調製した。サブピコモルのハプテンを認識できる抗体力価を有していた。
(2)光ラベルしたcMOAT(胆管側膜の薬剤排出ポンプ)を調製・精製した。基質特異性の高いプロテアーゼLys-Cでの消化で、3-4kDaの光ラベルされたペプチド断片が得られる条件を設定した後、抗ハプテン抗体を用いた免疫沈降法による精製を試みたが、沈降率が〜5%と低く、実用的精製には十分ではないことがわかった。
(3)別法として、Lys-C消化フラグメントを逆相系HPLCを用いて分画し、光ラベルフラグメントを含むそれぞれの画分をMALDI-TOF MS分析した結果・これまで我々、および他のグループが点変異法で明らかにした2ヶ所の膜貫通部以外に、新たに2ヶ所のヌクレオチド結合ドメイン近傍がラベルされたフラグメントに合致する分析値が得られた。これは新知見である。
(4)本法を一般化するには、高力価のハプテン抗体を得る方法が課題として残った。

研究成果

• [文献書誌] A.Kuniyasu, et al.: "CD36-mediated endocytic uptake of (AGE) in mouse 3T3-L1 and human subcutaneous adipocytes"FEBS Lett.. 537. 85-90 (2003)
• [文献書誌] H.Yoshikawa, et al.: "Photochemical identification of the binding region for (S)-semotiadil on sodium channels"Heterocycles. 59(2). 613-622 (2003)
• [文献書誌] A, Miyazaki, et al.: "Scavenger receptors that recognize advanced glycation end products"Trends Cardiovasc. Med.. 12(6). 258-262 (2002)
• [文献書誌] K.Kawahara, et al.: "Efficient identification of photolabeled amino acids by mmuno-purification and mass spectrometry"Biochem. J.. 363(2). 223-232 (2002)
• [文献書誌] A.Kuniyasu, et al.: "Adipocytes recognize and degrade oxidized LDL through CD36"Biochem. Biophys. Res. Commun.. 295(2). 319-323 (2002)
• [文献書誌] K.Kawahara, et al.: "Induction of CHOP and apoptosis by nitric oxide in p53-deficient microglial cells"FEBS Lett.. 506(2). 135-139 (2001)