| 研究概要 |
ファブリー病は,α-ガラクトシダーゼをコードする遺伝子変異が酵素活性の低下をもたらし,心臓などに糖セラミドが蓄積して障害を生ずる先天性代謝異常症である。同様に,α-N-アセチルガラクトサミニダーゼの遺伝子変異によりシンドラー病・神崎病が発症する。本研究では,これらリソソーム病に関わるヒトα-ガラクトシダーゼとα-N-アセチルガラクトサミニダーゼの三次元構造をX線結晶構造解析で明らかにし,病態の理解を深めることを目的とする。
研究の初年度として,ヒトα-ガラクトシダーゼの基質類似阻害剤デオキシガラクトノジリマイシンとの複合体のX線結晶構造解析を行った。さらに,実際に酵素活性の低下をもたらす遺伝子変異が導入された病態酵素のタンパク質2種を発現させることができ,試料の大量調製,結晶化とX線回折強度の測定,三次元構造の解析までを既に達成することができた。変異体の発現ベクターをメタノール資化酵母のゲノムに導入して高発現系を構築し,酵素に存在するアスパラギン結合型の糖鎖を酵素処理によって均一に短糖鎖化した。複合体結晶の調製は,阻害剤をネーティブ結晶に浸潤させるソーキング法と複合体を新たに結晶として析出させる共結晶化法によった。複合体および変異体のX線解析では,先に得たネーティブ結晶の構造を活用する分子置換法によった。
ヒトα-N-アセチルガラクトサミニダーゼについては,酵母による高発現系を用い,精製と短糖鎖化を行い,微小ながらも結晶を得ることができた。X線回折強度の測定を行ったところ,結晶サイズを大きなものに改善することが不可欠となった。α-N-アセチルガラクトサミニダーゼのX線解析では,既に得たα-ガラクトシダーゼの結晶構造を活用する分子置換法が適用できるので,結晶サイズの改善に成功すれば,直ちに三次元構造が得られるものと期待される。
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