| 研究概要 |
筋疾患原因遺伝子におけるSNPsを簡便に検索・同定する方法を確立するため、基盤となる高精度cDNAを用いた大規模マイクロアレイの作製を行った。これまでに確立されたプロトコルに従って、ヒト筋発現遺伝子のクローン化を行い、約5,200種のヒト筋発現cDNA断片をクローン化し蓄積した。収集されたcDNAクローンを用いて、大規模DNAチップを作製した。重要な遺伝子約500クローンについては、実験データの信頼性を高める目的で複数回スポットし、最終的には5,760スポットのチップIVを作製した。プローブ作成・検出法にはPerkin-Elmer社のTSA増感システムを採用した。ヒト骨格筋total RNAからのcDNAプローブを使い、作成したDNAチップの有効性を検討した。同量のプロープを用いた実験では相対蛍光強度100〜100,000のレンジで再現性(R=0.94〜0.98)のある結果が得られた。また、cDNAプローブ量がtotal RNA1〜4μgのレンジにおいて、ターゲットスポットの蛍光強度に直線性が得られた。さらに、ヒト骨格筋total RNAからのcDNAプローブで検出された各遺伝子ターゲットスポットの相対強度及び遺伝子発現順位は、Bortoluzziらが示したEST databaseからのTranscriptional Profile、大久保らのBody Mapの骨格筋発現での結果とよく一致していた。また、複数のターゲットスポットがある遺伝子においては、各々のターゲットスポットで同様の強度が得られた。マイクロアレイを用いてSNPs検出を行うための方法論については、ミスアニール部位結合タンパク質による検出法の確立を目指してこれら遺伝子の単離とrecombinantタンパク質の合成を試みた。残念ながらこれまでに試験管内で機能しうるミスアニール部位結合タンパク質を単離することができなかった。
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