イソプレノイド生合成におけるプレニル鎖延長酵素の触媒機能発現機構

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12480169
• 研究機関: 東北大学
• 研究代表者: 古山 種俊 東北大学, 多元物質科学研究所, 教授 (20089808)
• 研究分担者: 大谷 典正 山形大学, 理学部, 講師 (40302286)
• キーワード: プレニル鎖延長酵素 / ウンデカプレニル二リン酸 / プレニルトランスフェラーゼ / イソプレノイド / ファルネシル二リン酸 / イソペンテニル二リン酸 / 部位特異的変異導入 / 基質結合部位

研究概要

シス型プレニル鎖延長酵素として初めて研究代表者らがクローン化した、Micrococcus luteus B-P 26のウンデカプレニル二リン酸合成酵素(UPS)の部位特異的変異導入実験により、結晶構造解析でリン酸基の結合モチーフとして示唆されたP-ループ構造がアリル性基質FPPの二リン酸部の結合に関与しており、特に33位のアルギニンが直接FPPに結合していることが判明した。さらに42位のアルギニンも結合に重要であり、他の生物由来の酵素で32位のグリシンと相補的な関係にあることも明らかになった。
シス型鎖延長酵素反応が1回起こって生成されるシス-ゲラニルゲラニル二リン酸(Z-GGPP)は各変異導入酵素に対し、FPPと全く異なるK_m値を与えることが明らかになり、反応中間体となるZ-GGPPはP-ループとは結合せず、全く別の結合部位が存在する可能性を明確にした。ウンデカプレニル二リン酸合成酵素の効果的阻害剤探索を抗菌活性を示す各種の生薬を対象にして進めたところ、リノール酸が阻害作用を示すことが明らかとなった。さらにリノール酸の類似化合物を各種合成し、この酵素の阻害剤の化学構造と阻害作用の関係を追究し、ウンデカプレニル二リン酸合成酵素に有効な阻害剤の構造を明らかにした。
ヒトのデヒドロドリキル二リン酸合成酵素の遺伝子(hds)の他、パラゴムノキ(Hevea brasiliensis)のゴム合成酵素(hrt2)およびゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素遺伝子のcDNAクローニング、大腸菌細胞内での発現系構築に成功し、ヒトの糖タンパク質生合成の糖キャリアリピドや天然ゴムの生合成に関与する重要な酵素の構造と機能の相関を追究する基盤を確立した。

研究成果

• [文献書誌] M.Nagaki, H.Yamamoto, A.Takahashi, Y.Maki, J.Ishibashi, T.Nishino, T.Koyama: "Substrate Specificity of Thermostable Farnesvl Diphosphate Synthase with Respect to 4-Alkyl Group Homologs of Isopentenyl Diphosphate"J. Mol. Catal. B : Enzymatic. 17・2. 81-89 (2002)
• [文献書誌] Y.Maki, M.Komabayashi, Y.Gotoh, N.Ohya, H.Hemmi, K.Hirooka, T.Nishino, T.Koyama: "Dramatic Changes in the Substrate Specificities of Prenyltransferases by a Single Amino Acid Substitution"J. Mol. Catal. B. Enzymatic. 19-20. 431-4365 (2002)
• [文献書誌] 槙 雄二, 長岐正彦, 西野徳三, 古山種俊: "有機合成におけるイソプレノイド生合成関連酵素:酵素機能改変と炭素-炭素結合形成ツールとしての有用性と展望"有機合成化学協会誌. 60・8. 783-793 (2002)
• [文献書誌] A.Takaya, Y.-W.Zhang, K.Asawatreratanakul, D.Wititsuwannakul, R.Wititsuwannakul, S.Takahashi, T.Koyama: "Cloning, Expression and Characterization of a Functional cDNA Clone Encoding Geranylgeranyl Diphosphate Synthase of Hevea brasiliensis"Biochim. Biophys. Acta.. 1625・2. 214-220 (2003)
• [文献書誌] S.Endo, Y.-W.Zhang, S.Takahashi, T.Koyama: "Identification of Human Dehydrodolichyl Diphosphate Synthase Gene"Biochim. Biophys. Acta.. 1625・3. 291-295 (2003)
• [文献書誌] Y.Kharel, T.Koyama: "Molecular Analysis of cis-Prenyl Chain Elongating Enzymes"Natural Product Reports. 20・1. 111-118 (2003)
• [文献書誌] S.Takahashi, T.Nishino, T.Koyama: "Isolation and Expression of Paracoccus denitrificans Decaprenyl Diphosphate Synthase Gene for the Production of Ubiquinone-10 in E. coli"Biochem. Engineering. (印刷中). (2003)
• [文献書誌] M.Nagaki, K.Kuwahara, K.Kimura, J.Kawakami, Y.Miki, S.Ito, N.Morita, T.Nishino, T.Koyama: "Substrate Specificities of Medium-Prenylchain Elongating Enzymes, Hexaprenyl-and Heptaprenyl Diphosphate Synthases"J. Mol. Catal. B : Enzymatic. (印刷中). (2003)
• [文献書誌] K.Fujikura, Y.-W.Zhang, M.Fujihashi, K.Miki, T.Koyama: "Mutational Analysis of Allylic Substrate Binding Site of Micrococuus luteus BP 26 Undecaprenyl Diphosphate Synthase"Biochemistry. (印刷中). (2003)