研究課題
本年度はまず高等動物由来の構成型ヘム分解酵素であるヘムオキシゲナーゼ(HO-2)の高純度精製とX線結晶構造解析のための結晶化スクリーニングを行った。このタンパク質はいわゆる生化学研究のレベルでは、大腸菌の大量発現系を利用することにより、大量に精製することができた。しかし、精製の過程においてヘムオキシゲナーゼの末端アミノ酸が自発的もしくはタンパク質分解酵素によって分解されているために、試料の均一性が著しく失われるために、結晶化されることが非常に困難であることが判明した。そこで研究対象を少し変えて、バクテリアヘムオキシゲナーゼ(HmuO)の構造解析に取り組むことにした。HmuOはジフテリア菌のもつヘム分解酵素であり、HO-2と相同性の高いタンパク質である。HmuOについての構造解析は行われていなかったが、我々の研究はグループによって結晶化されることができていた。そこで結晶構造解析に平行してHmuOのキャラクタリゼーションを行うこととした。共鳴ラマン分光や可視吸収スペクトル測定などの各種分光測定により、HmuOのヘム近傍の構造はHO-2のものと類似していることが明らかとなった。さらに酵素反応解析やヘム近傍のアミノ酸変位体の作製を行い、酵素化学的な見地からHmuOとHO-2の違いについて議論した。HmuOの結晶は空間群P21で非対称単位あたり3つの分子を含むという複雑なものであったが、酸化型酵素と酸化型酵素のヘム鉄を還元剤で還元した還元型酵素について構造解析をすることができた。回折データ収集はSpring-8のBL45XUビームラインにおいて行い、酸化型酵素で1.4A、還元型酵素では1.7Aまでの回折データを収集することに成功した。
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