高度好熱菌由来酵素の低温適応変異体の解析

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12480184
• 研究機関: 東京薬科大学
• 研究代表者: 大島 泰郎 東京薬科大学, 生命科学部, 教授 (60167301)
• 研究分担者: 玉腰 雅忠 東京薬科大学, 生命科学部, 助手 (10277254)
• キーワード: 3-イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ / 高度好熱菌 / 進化分子工学 / 反応速度論 / ランダム変異

研究概要

当初の予定通り、好熱菌Thermus thermophilusが生産する熱安定な、しかし、常温では活性の低い酵素の常温適応変異体を得るため、実験室内進化系を構築した。得られた変異体酵素の構造および反応性を解析した。用いたモデル酵素はイソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼであり、この酵素をコードしている遺伝子はleuBと呼ばれる。今年度の成果は以下の通り。
1 すでに構築していた進化実験系を一部改変し、新たな常温適応変異酵素を取得した。これらの変異体酵素の多くは、常温での活性を改善すると共に、耐熱性を保持しており、高機能かつ高安定な酵素タンパク質は創製可能であるという研究計画の基盤となる予備的な知見を再確認した。
2 より多くの変異体を取得するために、これまでは自然変異体を利用していたが、PCRによるランダム変異を導入する方法を取り入れた。適当な条件の下では、これまでと同様にシングル変異体であったが、変異率を上げると、得られた常温適応変異体は予想されたとおり多重変異体であった。
3 反応速度論的な解析を行い、k_<cat>が改善されている変異体酵素とK_mが改善されている場合と2種の改変酵素が得られていることが明らかになった。
4 k_<cat>が改善されている変異体酵素では、ES複合体のエネルギーレベルが相対的に高く、その分活性化エネルギーが小さくなっていると解釈された。K_mが改善されている変異酵素では、活性化エネルギーが大きくなっている。k_<cat>とK_mを取り引きしているわけで、k_<cat>/K_m値の大きな理想的な酵素を創製するには、シングル変異では不十分である。

研究成果

• [文献書誌] Y.Hayashi-Iwasaki et al: "Purification and characterization of Recombinant 3-Isopropylmalate Dehydrogenases from Thermus thermophilus and Other Microorganisms."In "Methods in Enzymology" (eds.By RA.Harris,JR.Sokatch). 324. 301-322 (2000)
• [文献書誌] H.Hori et al.,: "Identification of Thermus thermophilus HB8 tRNA(Gm18)methyltransferase gene."Nucleic Acid Symp.. Ser44. 167-168 (2000)
• [文献書誌] N.Tanaka and T.Oshima: "Structure and Thermostability of 3-Isopropylmalate Dehydrogenase."Protein Peptide Letters,. 7[5]. 333-340 (2000)
• [文献書誌] T.Hori et al.,: "The initial step of the therma1 unfolding of 3-isopropylmalate dehydrogenase detected by the temperature-jump Laue method."Protein Engng.. 13[8]. 527-533 (2000)
• [文献書誌] Z.NURACHMAN et al.,: "Crystal structures of 3-isopropylmalate dehydrogenases with mutations at the C-terminus : Crystallographic analyses of structure-stability relationships"Protein Engng.. 13[4]. 253-258 (2000)
• [文献書誌] 大島泰郎: "高度好熱菌から学ぶ"第14回大学と科学シンポジウム「生物の働きを生み出すタンパク質のかたち」. 172-182 (2000)