高度好熱菌由来酵素の低温適応変異体の解析

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12480184
• 研究機関: 東京薬科大学
• 研究代表者: 大島 泰郎 東京薬科大学, 生命科学部, 教授 (60167301)
• 研究分担者: 玉腰 雅忠 東京薬科大学, 生命科学部, 助手 (10277254)
• キーワード: 進化分子工学 / 好熱性細菌 / イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ / 実験室内進化 / Directed Evolution / 熱安定酵素

研究概要

イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼをモデル酵素に選び、進化分子工学手法を用いたこれまでの研究から、熱安定性に優れているが常温での触媒活性の低い好熱菌の生産する酵素を、実験室内で常温環境に人為的に適応進化させると、1ないし数個のアミノ酸残基の変異により安定性を失わないまま常温の触媒活性を向上させることができることを見いだした。触媒効率の向上は、kcatを大きくする場合とKmを小さくする場合の二通りがある。この現象の分子的な機構を明らかにするために、触媒活性の詳細な反応動力学的、および速度論的な解析を行った。酵素反応のエネルギー準位は、まずES複合体を形成する段階で谷を作り、ついでこれが遷移状態に移るときに大きな山を、そして反応産物が形成されて深い谷へ落ちる。kcatを大きくするのは、遷移状態の山が低くなることを意味しているが、実験の結果はその通りであるが、その際、ES複合体状態の谷がより深くなることが見られた。これはkcatを大きくなった変異酵素のKmが一般的に大きくなるという実験結果とも一致している。一方、Km改良型の変異酵素では、遷移状態の山がより大きくなる現象を伴っており、これも実験の観察事実と一致していた。より具体的には、触媒反応がより効率的に改変されると、基質の結合がしにくくなる傾向があり、一方、基質が結合し易くなるよう活性中心構造が変化すると、遷移状態に導きにくい酵素ができることを示唆している。安定性を失うことなく、kcatが大きく、Kmが小さいという理想の酵素を創製できないか、変異を組み合わせて多重変異酵素を作ることを試みたが、理想的な酵素はまだ得られていない。

研究成果

• [文献書誌] M.Ishida, et al.: "Overexpression in Escherichia coil of the AT-rich trpA and trpB genes from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus"FEMS Microbiol. Letters. 216. 179-183 (2002)
• [文献書誌] M.ISHIDA, T.OSHIMA: "Effective Structure of a Leader Open Reading Frame for Enhancing the Expression of GC-Rich Genes"J. Biochem.. 132(1). 63-70 (2002)
• [文献書誌] T.Suzuki, et al.: "Sulfolobus tokodaii sp. nov. (f. Sulfolobus sp. strain 7), a new member of the Sulfolobus isolated from Beppu Hot Springs, Japan"Extremophiles. 6(1). 39-44 (2002)
• [文献書誌] C.Motono, et al.: "High thermal stability of 3-isopropylmalate dehydrogenase from Thermus thermophilus resulting from low deltaCp of unfolding"Protein Eng.. 14(12). 961-966 (2001)
• [文献書誌] M.Yasugi, et al.: "Analysis of the effect of accumulation of amino acid replacements on activity of 3-isopropylmalate dehydrogenase from Thermus thermophilus"Protein Eng.. 14(8). 601-607 (2001)
• [文献書誌] M.Yasugi, et al.: "Cold Adaptation of the Thermophile Enzyme 3-Isopropylmalate Dehydrogenase"J. Biochem.. 129(3). 477-484 (2001)