N-アセチルグルコサミン-6硫酸化の生物学的意義

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12480187
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 村松 喬 名古屋大学, 大学院・医学系研究科, 教授 (00030891)
• 研究分担者: 村松 寿子 名古屋大学, 大学院・医学系研究科, 講師 (50182134) ; 門松 健治 名古屋大学, 大学院・医学系研究科, 助教授 (80204519)
• キーワード: スルホトランスフェラーゼ / N-アセチルグルコサミン / L-セレクチン / L-セレクチンリガンド / オリゴ糖合成 / 糖タンパク質 / 血液凝固

研究概要

N-アセチルグルコサミン-6-スルスルホトランスフェラーゼ1(GlcNAc6ST-1)遺伝子のノックアウトマウスを作成した。このマウスのGlcNAc6ST-1が完全に欠失していることは、サザンブロッティングとノーザンブロッティングで確認した。ノックアウトマウスは正常に生まれ、目立った異常は示さなかった。現在バッククロスを重ねており、リンパ球ホーミング能との関連について解析を急いでいる。
ヒトGlcNAc6ST-1をプロテインAとの融合タンパク質としてTn5細胞でバキュロウィルス系で発現させた。組み換え体酵素をIgGセファロースカラムクロマトグラフィーで精製した。精製酵素の特異性は哺乳類細胞で発現したGlcNAc6ST-1と同じであった。精製酵素を6-スルホGlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcの合成に利用した。産物はMALDI-TOFで同定した。この産物は6-スルホGlcNAcに比べて、マウス大腸ミクロソーム画分のガラクトシルトランスフェラーゼによって、より効率的にガラクトシル化された。一方フィブリノーゲンを脱シアル化および脱ガラクトシル化した後、精製GlcNAc6ST-1とPAPSにより、6硫酸化した。硫酸化に伴ってトロンビンによるクロッティング時間が減少した。脱シルアル化により、クロティング時間は増加することが判明している。すなわち、陰電荷がクロッティング時間の減少に寄与していると考えられる。バキュロウィルス産生GlcNAc6ST-1はN-アセチルグルコサミン6硫酸化のための好適な試薬であると結論できる。

研究成果

• [文献書誌] Kenji Uchimura: "Specificities of N-acetylglucosamine-6-O-sulfotransferases in relation to L-selectin ligand synthesis and tumor-associated enzyme expression"The Journal of Biological Chemistry. 277. 3979-3984 (2002)
• [文献書誌] Kenji Uchimura: "Functional analysis of the chondoroitin 6-sulfotransferase gene in relation to lymphocyte subpopulation, brain development and oversulfated chondroitin sulfates"The Journal of Biological Chemistry. 277. 1443-1450 (2002)
• [文献書誌] Akiko Kanamori: "Distinct sulfation requirements of selectins disclosed using cells that support rolling mediated by all three selectins under shear flow"The Journal of Biological Chemistry. 277. 32578-32586 (2002)
• [文献書誌] Fathy M.El-Fasakhany: "N-Acetylglucosamine-6-sulfotransferase-1 : production in the baculovirus system and its applications to the synthesis of a sulfated oligosaccharide and to the modification of oligosaccharides in fibrinogen"Journal of Biochemistry. (in Press).