アミノ酸バランスを感知し、蛋白合成系・細胞成長・細胞周期を制御する分子基盤の解析

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12480190
• 研究機関: 神戸大学
• 研究代表者: 米澤 一仁 神戸大学, バイオシグナル研究センター, 教授 (70283900)
• 研究分担者: 吉野 健一 神戸大学, バイオシグナル研究センター, 助手 (90280792) ; 原 賢太 神戸大学, バイオシグナル研究センター, 助手 (70294254)
• キーワード: アミノ酸バランス / ラパマイシン / mTOR / 蛋白合成 / 細胞成長 / 細胞周期 / p70S6キナーゼ / DT40細胞

研究概要

(1)免疫抑制剤として知られるラパマイシンの標的蛋白mTORがアミノ酸バランスを感知し、蛋白合成系・細胞成長・細胞周期を制御する中心分子である事の証明:チキンB細胞であるDT40細胞は、高率にhomologous recombinationを起こす故、細胞レベルでの種々情報伝達分子のknockoutが行なわれ、それらの機能解析に役立っている。チキンTORのキナーゼドメインのエクソン・イントロンをクローニングし、それを使って、ターゲティングベクターを作製。1つめのalleleの破壊を数回試みたが、viableな細胞の獲得にいたっていない。現在、mTORをテトラサイクリンでon-offできる系をDT40細胞で確立し、ついで、knockoutを行なう予定である。
(2)mTORを介するシグナル伝達系、特に、細胞成長・細胞周期制御に及ぼすアミノ酸およびその誘導体の効果の解析:我々は、アミノ酸のうち、特にロイシンがアミノ酸によるp70S6キナーゼの活性化に大きな役割を果たしていることを示してきた。ロイシンの誘導体の中に、ラパマイシン感受性細胞株であるJurkat細胞の細胞周期を完全に阻害するものを発見し、この誘導体が、p27kip1の発現を増加し、Retinoblastoma蛋白の脱リン酸化を起こすことを発見した。
(3)mTORを介する情報伝達系に関与する新規シグナル伝達分子の探索:yeast two hybrid systemを用い、mTORのフラグメントをベイトに複数のmTOR結合蛋白の候補遺伝子を単離した。
(4)ハイブリッド型質量分析計を用いたmTORキナーゼのリン酸化部位の同定:mTORのリン酸化部位を、新型ハイブリッド型質量分析計を用いて分析した。その結果、mTOR上の複数のリン酸化候補部位が同定され、その部位の変異mTORを作成し機能への効果を検討中。

研究成果

• [文献書誌] Isotani,S.: "Immunopurified mammalian target of rapamycin phosphorylates and activates p70 S6 kinase alpha in vitro."J.Biol.Chem.. 10・8. 34493-34498 (1999)
• [文献書誌] Parekh,D.: "mTOR controls one of two kinase pathways acting upon nPKCδ and nPKCε."J.Biol.Chem.. 274・49. 34758-34764 (1999)
• [文献書誌] Yonezawa,K.: "Nutritional regulation of gene and protein expression"Curr.Opin.Clinic.Nutri.Metab.Care. 3. 253-254 (2000)
• [文献書誌] Takahashi,T.: "Carboxyl-terminal region conserved among phosphoinositide-kinase-related kinases is indispensable for mTOR function in vivo and in vitro."Genes to Cells. 5・9. 765-775 (2000)
• [文献書誌] Avruch,J.: "The p70 S6 kinase integrates nutrient and growth signals to control translational capacity."Progress in Molecular and Subcellular Biology. (in press).