| 研究課題/領域番号 |
12480204
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| 研究機関 | 国立遺伝学研究所 |
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研究代表者 |
西川 建 国立遺伝学研究所, 生命情報・DDBJ研究センター, 教授 (10093288)
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| 研究分担者 |
小林 薫(深海 薫) 国立遺伝学研究所, 生命情報・DDBJ研究センター, 助手 (20225494)
芝 清隆 (財)癌研究会, 癌研究所・蛋白創製研究部, 部長 (40196415)
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| キーワード | ペリプラズム結合タンパク質 / 分子進化 / 人工タンパク質デザイン / 進化工学 / 折れたたみパターン / キメラタンパク質 / アセンブリーPCR法 / タンパク質立体構造 |
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| 研究概要 |
ペリプラズム結合タンパク質の、進化のある一時点での「ストランドの入れ換わり」によるタイプ1からタイプ2への折れたたみの変化の要因を探るため、タイプ1タンパク質(MglBあるいはAraF)由来の2断片と、タイプ2タンパク質(ArgT)由来の2断片の4つの断片がキメラとなった人工タンパク質2種を大腸菌に発現させ、その物理化学的性質の解析を行なった。ペリプラズム移行シグナル配列を欠失させ、前駆体の混入を回避することにより純度の高い野生型及びキメラタンパク質を得ることができた。キメラタンパク質は細胞質内へ発現させると大腸菌の内で封入体を形成し不溶性タンパク質となったため、変性条件下で可溶化した後に精製し、透析により巻き戻しを行ない可溶性タンパク質として回収した。このようにして得られた野生型及びキメラタンパク質のCDスペクトルを測定し、両者の2次構造含量を比較した。キメラタンパク質は部分的には2次構造を保持しているものの、野生型と比べるとランダム構造の増加がみられた。また、平衡透析法でキメラタンパク質のリガンド結合能を測定したところ、野生型に比べて著しく減少していることが分かった。
続いてキメラタンパク質のリガンド結合能を回復させることを目標とし、ファージディスプレイ法によりリガンド結合能を獲得したキメラタンパク質変異体のセレクションを行なう実験系の構築を進めた。ミュータジェネシスPCRによりランダムに変異を導入したキメラタンパク質のファージディスプレイライブラリーを作製し、10e6-10e7種類の変異体の中から固相化したリガンドに対して結合能の上昇したものを選択する実験を現在進めている。
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