| 研究課題/領域番号 |
12480204
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| 研究機関 | 国立遺伝学研究所 |
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研究代表者 |
西川 建 国立遺伝学研究所, 生命情報・DDBJ研究センター, 教授 (10093288)
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| 研究分担者 |
小林 薫(深海) 国立遺伝学研究所, 生命情報・DDBJ研究センター, 助手 (20225494)
芝 清隆 (財)癌研究会, 癌研究所・蛋白創製研究部, 部長 (40196415)
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| キーワード | ペリプラズム結合タンパク質 / 分子進化 / 人工タンパク質デザイン / 進化工学 / 折れたたみパターン / キメラタンパク質 / アセンブリーPCR法 / タンパク質立体構造 |
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| 研究概要 |
ペリプラズム結合タンパク質の、「ストランドの入れ換わり」によるタイプ1からタイプ2への折れたたみ構造の進化の要因を探るため、立体構造の保存性に基づき、タイプ1タンパク質(MglB)由来の2断片と、タイプ2タンパク質(ArgT)由来の2断片の4つの断片がキメラとなった人工タンパク質を作成した。人工タンパク質のリガンド結合能を回復させることを目標とし、ファージディスプレイ法によりリガンド結合能を獲得したキメラタンパク質変異体のセレクションを行なう実験を行っていたが、非特異的な吸着が強く、期待したリガンド結合能回復クローンを得ることができなかった。そこで、キメラ人工タンパク質設計の再評価を次のように行った。まず、それぞれタイプ1、タイプ2に属するMg1BとArgTの立体構造の形成過程(フォールディング)がどのように異なっているかを尿素濃度勾配ゲル電気泳動、ゲルろ過クロマトグラフィー、ANS蛍光測定などの実験を行った。その結果、タイプ2タンパク質であるArgTの方が、タイプ1タンパク質であるMglBよりも複雑なフォールディング反応の過程を有することが明らかとなった(J. Biochem 133:371)。次いで、はじめにデザインした2断片を入れ換えたキメラタンパク質、および1断片のみを別のタイプに置換したキメラタンパク質のフォールディング反応を検討した結果、立体構造の保存性の良い部分を1断片入れ換えたキメラタンパク質のいくつかが協同的なフォールディングを示した(投稿中)。現在、これらのキメラタンパク質を試験管内進化系で改変し、それらを組み合わせることで、始めのデザインである2断片を置換したキメラタンパク質を作成することを目標に実験をすすめている。
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