| 研究概要 |
高等哺乳動物の内耳蝸牛における内リンパ液電位(Endocochlear Potential ; EP)とは、内耳蝸牛管内の内リンパ液が、その外側にある外リンパ液に対して示す直流電圧であり,これが聴覚の成立に必要不可欠であることが知られている。一方,この内リンパ液電位が如何にして生成、維持されるかは未だほとんど理解されていない。ギャップジャンクションの構成要素であるConnexin26は、ヒト非症候群性難聴DFN B1の原因遺伝子として知られているが、ラセン靱帯 FibrocyteにおいてBrn-4と供に内リンパ液電位を生成する機構の不可欠の要素であると考えられる。新しい技術であるConditional Gene Targeting法をマウスConnexin26遺伝子に応用する事により、ヒト難聴DFN B1のモデルマウスを樹立し、これを用いて、内リンパ液電位の起源におけるラセン靱帯Fibrocyteの機能と、その機構におけるBrn-4とC、Connexin26の関係を理解する事が本研究の目的である。実験は以下のような計画に基づいている。
(1)Pファージ由来の配列であるloxP配列を特異的に認識し,組換えを触媒する酵素Creの遺伝子をBrn-4 locusにKnock-inする。方法は置換型ベクターによる標的遺伝子細み換え法による。内耳におけるBrn-4の発現は,Connexin26の発現領域と良く一致しているので,ラセン靱帯fibrocyteで選択的にCre酵素を発現するマウスを得る事ができると考えられる。一方,同様に標的遺伝子組み換え法により,Connexin26遺伝子のSilent allele,即ち,Cre 酵素の非存在下では,正常な機能を保つalleleを持つマウスを作成する。交配により,このSilent alleleをホモに持つマウスを作製し,正常に発生発達することを確認する。
(2)Connexin26 Silent alleleのホモ接合体マウスと,Brn-4-Cre Knock-inマウスをかけあわせ、ラセン靱帯fibrocyteでの選択的なConnexin26欠損を誘導し、形態学的、生理学的解析を行う。又、聴覚器での発現が報告されているPO-Creマウスとの交配も検討する。
これまでに、Connexin26遺伝子のSilent alleleを持つマウスの作成に成功し、更に、交配により,このSilent alleleをホモに持つマウスを作製し,正常に発生発達することが確認された。更にCre Tgマウスとの掛け合わせを行い、聴覚機能解析を実施中である。
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