| 研究概要 |
-20Cで3ヶ月間凍結保存後、融解した牛胎児細胞からドナー核を作り出した。セルラインの7回から12回継代培養したものを本研究のドナー核として用いた。これらのドナー核にオワンクラゲ蛍光遺伝子、EGFPジーンフラグメントをリポゾームの媒介により牛胎児細胞内へ取り込んだ。牛胎児細胞は遺伝子導入前に4〜5日間飢餓状態に置くため、牛血清添加量を抑えた0.5%血清加DMEM培地内で順化させた。一方、除核卵子を準備するため、食肉処理場で得られた卵丘付き卵母細胞を修正卵管液で成熟培養し、20〜22時間後に5ug/mlサイトカラシンB+0.3%BSA加修正SOF液内で除核し、ドナー核を挿入して電気融合装置BTX2001によりDCパルス1kv/cm, 50マイクロ秒にてチマーマン液内で融合した。その後修正SOF液内で8日間培養し、発生した胚盤胞、拡張・脱出した胚盤胞への遺伝子導入成果を確認した。その結果、胚全体に遺伝子が導入されたものは11例(3.5%)で、このうち胚盤胞は1例(1.0%)に過ぎなかった。遺伝子導入例の大部分がモザイク状で26例(8.4%)にみられた。遺伝子導入核構築胚の一部は開発した陰圧式炭酸ガス培養器で培養しながら、日本(福岡)から中国(チンタオ)空港を経て、中国莱陽農業大学で準備した5頭の受胚牛へ移植実験を試みた。その結果、3頭が妊娠し、1頭は移植後60日後に流産、2頭が分娩した。これらの分娩牛からの遺伝子導入成功の有無については未だ確認されていない。
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