近接場光を導入したマルチ・モード光学顕微鏡システムの試作研究

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12557002
• 研究機関: 東京医科歯科大学
• 研究代表者: 片山 芳文 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 教授 (20014144)
• 研究分担者: 辰巳 仁史 名古屋大学, 大学院・医学研究科, 助教授 (20171720) ; 本間 知夫 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 助手 (80242246) ; 平井 恵二 東京医科歯科大学, 難治疾患研究所, 助教授 (70156628)
• キーワード: レーザー・ビーム / 光全反射 / 近接場光 / 微分干渉顕微鏡 / 落射蛍光顕微鏡 / 冷却CCDカメラ / 蛍光標識 / 脊髄後根神経節細胞

研究概要

近接場光を利用して、生きた細胞における生体機能性分子などの存在や動態をオンライン・リアルタイムで観測・解析できるシステムを試作するために、下記のような検討を行った。
1.直角プリズムをカバーグラスに貼り付け、プリズムからクリプトン・アルゴンレーザー・ビームを射入する。この時レーザー・ビームの入射角を変えながらカバーグラスの上・下両面で全反射が起こることを確認した。この直角プリズム付きのカバーグラスを倒立型微分干渉顕微鏡の架台に置いて、プリズム付きカバーグラスの上・下両面でビームが全反射しながらカバーグラス内を進行するようにレーザー・ビームを導入する光路を構成した。
2.次いで、カバーグラスの上面に近接場光が発生していることを蛍光ビーズを用いて確認した。すなわち、カバーグラス上面に直径0.1μmの蛍光ビーズを置いて、レーザー・ビーム照射による蛍光像とキセノン落射光照射による蛍光像を冷却CCDカメラで撮像して画像処理を施して比較検討した。後者のキセノン落射光照射では全視野に蛍光ビーズが観察されたが、前者ではレーザー・ビームの全反射スポットに対応した部位に限局してビーズが観察された。
3.各種伝達物質やレセプターを免疫化学的に蛍光標識することや組織化学的に標識することを試み、その状況を共焦点顕微鏡を用いて確認し、NPYなどのペプチドやアドレナリン受容体の存在、AChEの分布などの解析に近接場光を適用できる可能性を検討した。
4.幼若ラットの脊髄後根神経節細胞を急性単離して、直角プリズム付きカバーグラス上で培養した。この細胞に蛍光Ca指示薬fluo-3を負荷してレーザー・ビームで照射し、fluo-3蛍光を観測した。落射蛍光像に比べて、レーザー・ビーム照射では限局した蛍光像が得られ、近接場光内に入った(恐らく膜直下の)領域のCa濃度を計測できると考えられる。

研究成果

• [文献書誌] Imai K,Tatsumi H & Katayama Y: "Mechanosensitive Cl channels on the growth cones of the cultured rat dorsal root ganglion neurons."Neuroscience. 97. 347-355 (2000)
• [文献書誌] Terai T,Furukawa T,Katayama Y et al: "Effects of external acidosis on HERG current expressed in Xenopus oocytes."J.Mol.Cell.Cardiol.. 32. 11-21 (2000)
• [文献書誌] Yamashita Y,Hirai K,Katayama Y et al : "Mutations in sixth transmembrane domain of AQP2 inhibit its translocation induced by vasopressin."Amer.J.Physiol.. 200. F395-F405 (2000)
• [文献書誌] Ishii K,Hashikawa T,Hirai K et al: "Staining of acetylcholinesterase activity of the enteric nervous system by means of intracardiac perfusion of ...."Proc.Jpn.Acad.. 76B. 82-86 (2000)
• [文献書誌] Tuchiya H,Hirai K & Katayama Y: "Fluorescence-immunohistochemistry of NPY in the enteric nervous system of the guinea-pig intestine."Autonomic Neuroscience. 82. 36-37 (2000)