光学的手法FRETの適用による膜機能分子の構造変化と分子相互作用の研究の新展開

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12557004
• 研究機関: 東京医科歯科大学
• 研究代表者: 久保 義弘 東京医科歯科大学, 大学院・医歯学総合研究科, 教授 (80211887)
• キーワード: IRK1チャネル / FRET / Cys変異 / 構造変化 / イオン透過

研究概要

分子内構造の変化を光学的に解析するためには、目的とする場所に特異的に蛍光ラベルを導入することが鍵となる。そこで、研究の第一歩としてクローン化された内向き整流性K^+チャネルIRK1を対象としてこの点についての検討を進めた。点変異により導入したCys残基を利用する方法により化学ラベルを試みたところ、IRK1チャネルのCys149といったポアの外側入り口に、チャネル機能を障害することなく導入することができた。この際、発現系に内因的に存在する他の膜蛋白へのラベルの非特異的導入がバックグラウンドとして起きた。しかし、IRK1チャネルをpCXN_2高発現ベクターに組み入れHEK293T細胞に導入し、チャネルの発現密度を飛躍的に高めることにより、他の蛋白によるバックグラウンドと識別することに成功した。今後、チャネルの状態変化に伴う導入した蛍光強度の変化について定量的な解析を進め、さらに2種の蛍光色素をラベルしてエネルギー転移の評価による構造変化の解析を行う。
一方、研究の主対象である、IRK1チャネルについて、そのポア内側の構造を探る電気生理学的実験を行った。その結果、細胞内領域と想定されてきた長いC端のチェーンの遠位部にあるE299が,内向き整流性とイオン透過を決定する新たな構造基盤であること、すなわち,E299がポア内側部のイオン透過路に面していることが明らかになった。このことは、IRK1チャネルのポア内側部が、これまでの想定を遙かに超える大きなものであることを示唆する。そこで、今後、IRK1チャネルのポア内側部を対象として、FRET法による構造解析を進めていく。

研究成果

• [文献書誌] Murata,Y,Okado,H.and Kabo,Y: "Characterization of heteromultimeric G-protein coupled inwardly rectifying potassium channels of the tunicate tadpole with a unique property."Journal of Biological Chemistry. (in press).
• [文献書誌] Kubo,Y.and Murata,Y.: "Control of rectification and permeation by two distinct sites after the second transmembrane region in kir2.1 k^+ channel."Journal of Physiology. 531. 645-660 (2001)
• [文献書誌] Soon,M.,Schonherr,R.,Kubo,Y.,Kirsch,C.,Klinger,Rand Heinenann,S.H.: "Multiple P1P2 binding sites in kir2・1 inwardly rectifying potassium channels."FEBS letters. (in press). (2001)
• [文献書誌] Kubo,Y.: "Overviews of potassium channel families : Molecular bases of the functional diversity in "Pharmacology of ionic channel function (eds.Endo,M.et al.)""Experimental Pharmacology. 147. 157-176 (2000)