ペルオキシソーム欠損症全相補性群の遺伝子診断法の確立と遺伝子治療法開発の基礎研究

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12557017
• 研究機関: 九州大学
• 研究代表者: 藤木 幸夫 九州大学, 大学院・理学研究院, 教授 (70261237)
• 研究分担者: 角尾 肇 明治乳業(株), ヘルスサイエンス研究所, 医薬品開発部長・研究者 ; 原野 友之 九州大学, 大学院・理学研究院, 助手 (80037275) ; 田村 茂彦 九州大学, 大学院・理学研究院, 助教授 (90236753)
• キーワード: ペルオキシソーム / ペルオキシソーム欠損症 / 相補性群 / 患者解析 / CHO変異細胞 / ペルオキシソーム形成因子 / 膜タンパク質 / 蛋白質-蛋白質間相互作用

研究概要

1)私たち独自に分離したCHO変異細胞ZPG208に対しラットcDNA libraryを用いた機能相補活性スクリーニング法によりペルオキシソームの形成異常を相補するPEX3遺伝子のクローニングに成功した。ついでこのPEX3がペルオキシソーム欠損症相補性群G群の病因遺伝子あることを以下の知見により見出した。
i)ZPG208細胞と同じ相補性群である相補性群G群の患者由来細胞にPEX3を発現させたところペルオキシソームの形成障害が相補された。ii)この患者細胞のPEX3遺伝子をRT-PCR法により解析したところ、1塩基置換によるエクソン11の欠失をホモ接合型として有していた。iii)この変異型PEX3は相補活性を有していないことがZPG208細胞および患者細胞において確認された。一方、PEX3遺伝子変異細胞ではペルオキシソームの膜形成にも異常を有することから、ZPG208細胞は膜形成の分子機構を解明するうえでも有用性が高い。
2)私たちは、PTS1レセプターであるPex5pには哺乳動物系ではアイソフォーム、Pex5pSおよびPex5pL(S型内部に37アミノ酸配列の挿入が認められる)が存在することを先に見出している。両者の機能に関し、新たに分離した特異的表現型(PTS2タンパク質の輸送のみに異常を示すが変異遺伝子はPTS1レセプターをコードするPEX5であった)を示すCHO変異細胞ZPG231の分子細胞生物学解析から、PTS1タンパク質輸送に関わる一方、Pex5pLはPTS2タンパク質の輸送をPTS2レセプターPex7pと結合することにより担っていることを見出した。またこれらのカーゴ・レセプター複合体はPex14p,Pex13pを主体とした膜透過装置を経てペルオキソーム内へ局在化されることも見出した。今後これら諸因子を用いることにより膜透過過程の詳細な解析が可能になると考えられる。
3)ペルオキシソーム膜透過装置の構成因子の一つと考えられるPex12pについて、まずPEX12異常CHO変異細胞ZP104およびZP109の変異部位を決定、ついでPex12pの構造と機能に関し検討した結果、C-末端部に存在する亜鉛フィンガーRINGはPex12pの機能に必須であることを明らかにした。またPex12pは他のペルオキシンPex5p,Pex10pなどと相互作用することも見出した。今後、カーゴタンパク質のオルガネラマトリックス側での解離機構や両レセプターの細胞質へのシャトル機構などの解明が待たれる。

研究成果

• [文献書誌] Matsumoto,N.: "The peroxin Pex6p gene is impaired in peroxisome biogenesis disorders of complementation group6."J.Hum.Genet.. 46(in press). (2001)
• [文献書誌] Honsho,M.: "Topogenesis of peroxisomal membrane protein requires a short, positively charged intervening-loop sequence and flanking hydrophobic segments : STUDY USING HUMAN MEMBRANE PROTEIN PMP34."J.Biol.Chem.. 276(in press). (2001)
• [文献書誌] Otera,H.: "Biogenesis of nonspecific lipid transfer protein and sterol carrier protein x : studies using peroxisome assembly-defective pex cell mutants."J.Biol.Chem.. 276. 2858-2864 (2001)
• [文献書誌] Ghaedi,K.: "PEX3 is the causal gene responsible for peroxisome membrane assembly-defective Zellweger syndrome of complementation group G."Am.J.Hum.Genet.. 67. 976-981 (2000)
• [文献書誌] Shimozawa,N.: "Identification of PEX3 as the gene mutated in a Zellweger syndrome patient lacking peroxisomal remnant structures."Hum.Mol.Genet.. 9. 1995-1999 (2000)
• [文献書誌] Okumoto,K.: "Molecular anatomy of the peroxin Pex12p : RING finger domain is essential for the Pex12p function and interacts with the peroxisome targeting signal type 1-receptor Pex5p and a RING peroxin, Pex10p."J.Biol.Chem.. 275. 25700-25710 (2000)
• [文献書誌] Fujiki,Y.: "Review : Peroxisome biogenesis and peroxisome biogenesis disorders."FEBS Lett.. 476. 42-46 (2000)
• [文献書誌] Matsumura,T.: "Disruption of interaction of the longer isoform of Pex5p, Pex5pL, with Pex7p abolishes the PTS2 protein import in mammals.Study with a novel PEX5-impaired Chinese hamster ovary cell mutant."J.Biol.Chem.. 275. 21715-21721 (2000)
• [文献書誌] Ghaedi,K.: "The peroxin Pex3p initiates membrane assembly in peroxisome biogenesis."Mol.Biol.Cell. 11. 2085-2102 (2000)
• [文献書誌] Imamura,A.: "Temperature-sensitive mutation in PEX6 represents the milder phenotype of peroxisome biogenesis disorder in compelementation group C (CG-C) : comparative study for temperature-sensitive mutations"Pediatr.Res.. 48. 541-545 (2000)
• [文献書誌] Otera,H.: "Pex5pL, the longer isoform of mobile PTS1-receptor, functions in a novel and pivotal, Pex7p-mediated PTS2 import pathway via its initial docking site Pex14p."J.Biol.Chem.. 275. 21703-21714 (2000)
• [文献書誌] Imamura,A.: "Restoration of biochemical function of peroxisome in the temperature-sensitive mild forms of peroxisome biogenesis disorder in humans."Brain & Development. 22. 8-12 (2000)
• [文献書誌] Shimozawa,N.: "Molecular mechanism of detectable catalase-containing particles, peroxisomes in fibroblasts from a PEX2-defective patient."Biochem.Biophys.Res.Commun.. 268. 31-35 (2000)