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PKR抑制作用
PKRは、interferonによって誘導され、eIFのリン酸化によりウイルスRNAの翻訳を阻害する酵素であり、interferonの抗ウイルス作用の中心をなす分子である。NS5AはISDR依存性にPKR機能を抑制する。酵母内でPKRを発現させると、その蛋白翻訳抑制作用により、酵母の増殖は抑制され、この抑制作用はNS5Aの同時発現によりISDR依存性に阻害される。この系を利用して、PKR-NS5A相互作用を抑制する分子をreverse two hybrid assayにより同定する。すなわち、PKRおよびNS5A発現酵母内に肝臓由来libraryおよびrandom peptide libraryを導入し、PKR-NS5A相互作用を抑制する分子のscreeningを行うための予備的検討を行った。
NS5A抑制性分子・peptideについての臨床応用の可能性の検討
HCV replicon systemを確立、培養細胞内でHCV-RNAを持続複製する系を開発した。さらに、この系を用いてNS5A機能を抑制する分子を同定するための予備的検討として、replicon systemでの薬剤感受性、NS5A変異の影響、retrovirus libraryでのscreening法の検討を行った。以上の検討で得られた候補分子、peptideについてその阻害作用機序がNS5Aとの直接の相互作用によるものか、あるいはNS5A機能に関連する他の細胞内因子との相互作用による間接的なものによるものかを検討し、NS5A機能解析をさらに進める予定である。また、NS5A機能抑制分子を培養細胞内にNS5A蛋白とともに発現させ、NS5Aによるinterferon作用抑制に対する影響を検討する。NS5A発現培養細胞にHCV repliconを導入し、この候補分子がこのNS5Aによるrescue作用に拮抗するかどうかを検討する。
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