多機能成長因子CTGF/エコジェニンのドメイン別測定法の開発と臨床検査法への応用

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12557154
• 研究機関: 岡山大学
• 研究代表者: 滝川 正春 岡山大学, 歯学部, 教授 (20112063)
• 研究分担者: 服部 高子 岡山大学, 歯学部, 助手 (00228488) ; 久保田 聡 岡山大学, 歯学部, 助手 (90221936) ; 中西 徹 岡山大学, 歯学部, 助教授 (30243463) ; 椋代 義樹 岡山大学, 歯学部, 教務員 (50325099)
• キーワード: CTGF / 軟骨細胞 / 骨芽細胞 / CCNファミリー / ELISA / 細胞分化

研究概要

1 ドメイン別発現プラスミド、及びその他変異体CTGF/エコジェニン遺伝子の作製-CTGF/エコジェニンcDNAに遺伝子操作を加え、構成する4個のドメイン-IGF結合タンパク質様ドメイン(IGFBP)、フォンビルブランドファクター・タイプCリピートドメイン(VWC)トロンボスポンジンタイプ1リピートドメイン(TSP1)、C末ドメイン(CT)を様々な形で欠損させた変異遺伝子を作成した。それらは真核細胞発現ベクターpcDNA3.1(-)に組み込まれ、哺乳類細胞における一過性過剰発現と、安定発現株の樹立に供用されている。このような形で本年度に構築を完了した変異体は以下の通りである。シングルドメイン発現ベクター:1)IGFBP、2)VWC、3)TSP1、4)CT。デュアルドメイン変異体発現ベクター:5)IGFBP+VWC、6)VWC+TSP1、7)TSP1+CT。シングルドメイン欠損変異体発現ベクター:8)VWC+TSP1+CT、9)IGFBP+VWC+CT。以上の変異体のうち、IGFBPを欠くものに関しては、細胞外分泌に必要なシグナルペプチドも除去したもの、及びN末端にシグナルペプチドを付加したもの両方を構築した。完成したプラスミドについてはすべてDNAシークエンシングを行い、その構造が完全であることを確認済みである。現在それぞれを用い様々な側面から機能解析を進めている。
2 CTGF欠損変異体の検知、定量のための抗体の調製と解析-従来使用してきたCTドメインに対する抗血清に加えて、全長CTGFタンパク質に対して得られた新たなウサギ抗血清のIgG画分を精製しその性質を解析した。新たな抗血清は、従来のものより特異性が高く、またCTドメイン以外の部分を認識することが示唆されたので、今後の応用に向けて期待されている。既存のモノクローナル抗体の解析は現在進行中である。

研究成果

• [文献書誌] Kubota,S.: "Novel intracellular effects of human connective tissue growth factor expressed in Cos-7 cells."FEBS Letters. 474. 58-62 (2000)
• [文献書誌] Kubota,S.: "Identification of an RNA element that confers post-transcriptional repression of connective tissue growth factor/hypertrophic chondrocyte specific 24(ctgf/hcs24)gene : Similarities to retroviral RNA-protein interactions."Oneogene. 19. 4773-4786 (2000)
• [文献書誌] Seiji Kondo.: "Characterization of a mouse ctgf 3'-UTR segment that mediates repressive regulation of gene expression."Biochemical and Biophysical Research Coommunucations. 278. 119-124 (2000)
• [文献書誌] Nakanishi,T.: "Effects of CTGF/Hcs24, a product of a hypertrophic chondrocyte-specific gene, on the proliferation and differentiation of chondrocytes in culture"Endocrinology. 141. 264-273 (2000)
• [文献書誌] Nishida,T.: "Effects of CTGF/Hcs24, a hypertrophic chondrocyte-specific gene product, on the proliferation and differentiation of osteoblastic cells in vitro"J.Cell.Physiol.. 184. 197-206 (2000)
• [文献書誌] Takigawa,M.: "Tissue Engineering for Therapeutic Use"Physiological roles of connective tissue growth factor(CTGF/Hcs24) : promotion of endochondral ossification, angiogenesis and tissue remodeling. 192 (2000)