| 研究課題/領域番号 |
12557192
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| 研究機関 | 岡山大学 |
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研究代表者 |
村山 洋二 岡山大学, 歯学部, 教授 (50029972)
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| 研究分担者 |
西村 英紀 岡山大学, 歯学部・付属病院, 講師 (80208222)
新井 英雄 岡山大学, 歯学部・付属病院, 講師 (70222718)
高柴 正悟 岡山大学, 歯学部, 助教授 (50226768)
原田 慶宏 ライオン株式会社, 研究開発本部・生物科学センター, 副主任研究員
苔口 進 岡山大学, 歯学部, 助教授 (10144776)
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| キーワード | 歯周病細胞 / リアルタイムPCR / 16S rRNA / 細菌検査 |
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| 研究概要 |
1.液相ハイブリダイゼーションの検討
16S rRNA遺伝子の保存領域からプライマーを設計し、すべての菌種の16S rRNA遺伝子を増幅可能とした。このPCR産物にacridinium ester標識した菌種特異的プローブをハイブリダイズさせ、歯周病細菌の検出を試みた。標識したacridinium esterはプローブがハイブリダイズ反応で2本鎖DNAを形成することでその後の加水分解操作から保護され、シグナル光を発生させる。この加水分解からの保護は、標識がプローブの中央に位置した場合には高い確率で行われることが報告されている。しかしながら、オリゴプローブ中央へのacridinium ester標識はパテントの理由で日本国内での発注が不可能であった。そこで、標識をプローブの末端に行い、検出を試みた。結果、加水分解やハイブリダイズ反応の条件を様々変更してみたが、検出感度、特異性ともに満足のいく結果を得られなかった。
2.リアルタイムPCR法の検討
液相ハイブリダイゼーションによる検出系は、プローブの標識法の問題点から歯周病細菌の検査システムに応用することが困難であった。そこで、リアルタイムPCR法を応用した検査システムを開発することとした。PCR反応のモニタリングにはパーキンエルマー社のGeneAmp5700を用いた。P.gingivalis,P.intermedia,A.actinomycetemcomitans,P.nigrescenceの各菌種について特異プライマーを設計し、特異性、感度、定量性について検討した。各菌種のプライマーはそれぞれがターゲットとする菌種とのみ特異的に反応し、感度は従来のPCR法と同じく10^2レベルであった。リアルタイムPCR法は特に定量性に優れた方法であり、10^2-10^7の範囲での定量が可能であった。
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