| 研究課題/領域番号 |
12557214
|
|---|
| 研究機関 | 神戸薬科大学 |
|---|
研究代表者 |
菅原 一幸 神戸薬科大学, 薬学部, 教授 (60154449)
|
|---|
| 研究分担者 |
野水 基義 北海道大学, 大学院・地球環境科学研究科, 助教授 (00311522)
山田 修平 神戸薬科大学, 薬学部, 講師 (70240017)
北川 裕之 神戸薬科大学, 薬学部, 助教授 (40221915)
中島 元夫 ノバルティスファーマ(株), 研究本部, サイエンティフィックエキスパート
|
|---|
| キーワード | ヘパラナーゼ / ヘパラン硫酸 / 硫酸化オリゴ糖 / 癌転移 / 癌抑制遺伝子 / 遺伝子構造 |
|---|
| 研究概要 |
(1)ヒトのEXTL2cDNAの塩基配列を用いてEST(Expressed Sequence Tags)データーベースを検索し、マウスEXTL2に相当するクローンを見つけた。これより得られた塩基配列の情報を基にプライマーを合成し、マウス脳cDNAを鋳型としてPCR法を用いマウスEXTL2のcDNAをクローニングした。このcDNAを発現ベクターに組み込み、COS-1細胞を用いて発現させその酵素活性を確認した。このマウスEXTL2のcDNAを用いてノーザン解析及びRT-PCR法によりそれらのmRNAの組織分布を調べたところ、調べた限りすべての組織で発現が見られたが、その発現量は組織特異的であった。さらに、in situハイブリダイゼーション法を用い詳しく解析したところ、ほとんど全ての細胞がこのmRNAを発現していることが明らかとなった。また、マウスEXTL2のcDNAをプローブとして、この遺伝子をクローニングし、遺伝子構造も明らかにした。
(2)癌細胞が組織へ浸潤、転移していく際には、癌細胞の分泌するヘパラナーゼによって基底膜のヘパラン硫酸(HS)が分解される過程が含まれる。ヘパラナーゼがHS鎖中のbeta-D-グルクロニド結合を特異的に分解することは分かっていたが、詳細な基質特異性はまだ明らかになっていない。そこで、ヘパリン(Hep)及びHSから調製した様々な構造既知の硫酸化オリゴ糖を用い、ヒトヘパラナーゼの基質特異性を調べた。発現ベクターにヒトヘパラナーゼcDNAを組み込み、リポフェクション法によりヒトメラノーマ細胞に導入し、発現させたヘパラナーゼをアフィニティークロマトグラフィーで精製した。精製ヒトヘパラナーゼを用いて、Hep/HS由来の20種類の構造既知の硫酸化六糖及び四糖に作用させ、消化物をHPLCで分析した。その結果、グルクロニド結合の周辺が高硫酸化されたオリゴ糖ほど、より分解を受けやすいことがわかった。
|
