集団分子診断を目指した蛍光相関遺伝子検出システムの開発

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12557235
• 研究機関: 北海道大学
• 研究代表者: 金城 政孝 北海道大学, 電子科学研究所, 助教授 (70177971)
• 研究分担者: 石館 文善 カールツァイス株式会社, 顕微鏡部システム研究グループ, グループ長(研究職) ; 野村 保友 北海道大学, 電子科学研究所, 助手 (80237883) ; 西村 吾朗 北海道大学, 電子科学研究所, 助手 (30218193)
• キーワード: FA-PCR / PCR / 蛍光測定 / 蛍光相関分光法 / 遺伝子発現 / 単一分子検出 / SNP

研究概要

特定遺伝子やその発現の検出には、様々な手法の中でもPCR(Polymerase Chain Reaction)やRT-PCR法が知られているが、莫大な試料数を処理しようとすると、その定量性の低さとともに煩雑な操作性が短所とされ、大集団への応用は制限されている。
一方、申請者等は極微小領域を出入りする蛍光分子の動きに由来する蛍光揺らぎを測定することで、蛍光分子の数とその大きさを検出する蛍光相関分光法を開発研究をすすめてきた。
本研究は、一本鎖短鎖DNA(プライマー)から二本鎖長鎖(ターゲットDNA)へと長さと構造がともに変化し、そのため並進拡散定数(ブラウン運動の速さ)が大きく変化する。その速度変化を蛍光相関分光法を用いて簡便に、しかも単一分子レベルの高感度で測定することで標的遺伝子の増幅過程を反応溶液中にて定量することを目的とした。
これまでのような電気泳動やビーズ結合法などのB/F分離過程を含まない特徴を用いて、一度に1000近くの試料を対象とした遺伝子発現検出装置の試作開発を行った。
これまでにローダミンを用いた蛍光標識非対称遺伝子増幅反応液の一部5μlをFCSの対物レンズ上のカバーグラス上に移して最初の鋳型に依存してPCR産物が増加することを確認した。
また、これまでに、装置の試作をおこない、既設のFCS装置の試料台を電動化を行い、96ウェルならびに384ウェルのコントロールを可能にした。
試作装置の制作と平行して暫定的な手法としてカバーガラスが底辺に張られて96ウェルを利用して、新規に購入したPCR装置を利用してPCRの温度変化に耐えられるかどうかを検討した結果、温度の上昇、ならびに滑降温度速度を緩やかにすることで克服するめどがついた。
また、研究の過程で、SNP(Single Nucleotide Polymorphisms)にの検出にの可能性についても見当を行い、良好な結果を得た。

研究成果

• [文献書誌] Nomura, Y.: "Monitoring of in vivo and in vitro translation of green fluorescence protein and its fusion proteins by fluorescence correlation spectroscopy."Cytometry.. 44. (2001)
• [文献書誌] Yoshida, N: "Microenvironment of endosomal aqueous phase investigated by the mobility of microparticles using fluorescence correlation spectroscopy."Biochem.Biophys.Res.Comm.. 280. 312-318 (2001)
• [文献書誌] Yoshida, N: "Fluorescence correlation spectroscopy : A new tool for probing the microenvironment of the internal space of organelles."Single Molecules.. 1. 279-283 (2001)
• [文献書誌] Terada, S: "Oligomeric tubulin in large transporting complex is transported via kinesin in squid giant axons."Cell. 103. 141-155 (2000)
• [文献書誌] 金城政孝: "ConfoCor : 蛍光相関顕微鏡"細胞. 38. 254-258 (2000)
• [文献書誌] Pack, C-G: "Effect of electrostatic interaction on the binding of charged substrate to GroEL studies by high sensitive fluoresccence correlation spectroscopy."Biochem Biophysi Res Comm.. 267. 300-304 (2000)
• [文献書誌] 宮脇敦史: "GFPとバイオイメージング"羊土社. 276 (2000)