(6-4)光産物からデュワー産物への異性化を指標とした太陽光紫外線線量計の開発

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12558059
• 研究機関: 金沢大学
• 研究代表者: 二階堂 修 金沢大学, 薬学部, 教授 (60019669)
• 研究分担者: 松永 司 金沢大学, 薬学部, 助教授 (60192340)
• キーワード: 損傷認識モノクローナル抗体 / デュワー型光産物 / ドットブロット解析 / 酵素標識免疫測定法(ELISA) / ECL(化学発光増感)法 / 太陽光紫外線 / UVC

研究概要

デュワー型光産物(DwP)は太陽光紫外線で誘発される二量体型損傷の一つであり、(6-4)光産物(64P)から太陽光紫外線に含まれる320nm前後の紫外線によって光異性化されて二次的に生じる。DwPは太陽光紫外線により細胞DNAに蓄積し、長く残存するためその変異源性が注目されている。従ってヒトにおけるDwPに起因するリスク推定のためには、太陽光紫外線中に含まれる320nm付近の波長域の線量測定が必要である。しかし当該波長域の紫外線線量を測定する既存の機器は、測定波長域の狭間にあるため無きに等しく、本研究で開発する太陽光紫外線線量計の意義は大きい。
1.太陽光紫外線暴露により64PからDewarPが生成することの実証試験
UVC(<290nm)はDNA中にシクロブタン型ピリミジン二量体(CPD)と64P等の損傷を誘発する。一方、様々な波長の紫外線(290nm〜400nm)を含む太陽光はCPD、64PとDwPを誘発する。本試験では、先ず始めに種々のUVC線量を照射したDNAに太陽光を4時間にわたって照射した。DNA中に残存している64Pと生成したDwPを損傷認識モノクローナル抗体を用いたECL(化学発光増感)-ELISA(酵素標識免疫測定法)で測定したところ、64Pの減少とDwPの増加が鏡像関係を示した。この結果は、太陽光紫外線が64Pを光異性化してDwPに変換したことを示すと同時に、64Pを誘発したDNA標品が320nm域の線量を測定する線量計となり得ることを示すものである。
2.ECL法を用いたELISAの樹立
DwPを初めとするDNA損傷を高感度に検出することを目的として従来のELISA法を改良した。マイクロプレートにLumiNunc^<TM>を、化学発光基質としてSuperSignal^* ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate(Pierce,IL)を用いた。その結果、0〜1J/m^2のUVC線量域で損傷(CPD)の直線的検出が可能となった。従来の方法に比べ10〜20倍程度の検出感度の上昇が見られた。今後は64PとDwPの定量的検出にも本系を適用する予定である。
3.免疫ドットブロット法(IDB)を利用した損傷検出系の開発
plasmid DNAに各種の紫外線を照射し、種々の損傷修復タンパクで消化後、超螺旋型から開環型への変換を測定して検量線を求め、一方でECLを利用したIDB法を結合抗体の検出に利用して各種抗体が結合する損傷数を決定した。その結果、DwPは人工太陽光紫外線照射で多く誘発され流ことが判明した。しかもCHO細胞では64Pのそれとは異なり、CPDと同様にゆっくりと修復されることが分かった(24時間後に約50%の損傷が残存する)。従って太陽光紫外線に暴露された際の主たる損傷はCPDとDwPであり、それらは共に変異源性が高いことを示唆する結果を得た。また今後は64PからDwPへの光異性化が1分子から1分子への変換であることを何らかの方法で確認する必要がある。

研究成果

• [文献書誌] Otoshi,E.: "Respective role of cyclobutane pyrimidine dimers, (6-4) photoproducts, and minor photoproducts in ultraviolet mutagenesis of repair deficient xeroderma pigmentosum A cells."Cancer Res.,. 60(6). 1729-1735 (2000)
• [文献書誌] Ide,F.: "In vivo detection of ultraviolet photoproducts and their repair in Purkinje cells."Lab.Invest.. 80(4). 465-470 (2000)
• [文献書誌] Horiki,S.: "Protective effects of sunscreening agents on photocarcinogenesis, photoageing, and DNA damage in XPA gene knockout mice."Arch.Delmatol.Res.. 292(10). 511-518 (2000)
• [文献書誌] Torizawa,T.: "DNA binding mode of the Fab fragment of a monoclonal antibody specific for cyclobutane pyrimidine dimer."Nucleic Acids Res.,. 28(4). 944-951 (2000)
• [文献書誌] Perdiz,D.,: "Distribution and repair of bipyrimidine photoproducts in solar UV-irradiated mammalian cells.Possible role of Dewar photoproducts in solar mutagenesis."J.Biol.Chem.. 275(35). 26732-26742 (2000)
• [文献書誌] Yokoyama,H.: "Crystal structure of the 64M-2 antibody Fab fragment in complex with a DNA dt (6-4) T photoproduct formed by ultraviolet radiation."J.Mol.Biol.,. 299(3). 711-723 (2000)
• [文献書誌] Cario-Andre,M.: "Studies on epidermis reconstructed with and without melanocytes : melanocytes prevent sunburn cell formation but not appearance of DNA damaged cells in fair-skinned caucasians."J.Invest.Dermatol.. 115(2). 193-199 (2000)
• [文献書誌] Ray,AJ.: "The spectrum of mitochondrial DNA deletions in a ubiquitous marker of ultraviolet radiation exposure in human skin."J.Invest.Dermatol.. 115(4). 674-679 (2000)
• [文献書誌] Budiyanto,A.: "Protective effect of topically applied olive oil against photocarcinogenesis following UVB exposure of mice."Carcinogenesis,. 21(11). 2085-2090 (2000)
• [文献書誌] Horiki,S.: "Protective effects of sunscreening agents on photocarcinogenesis, photoaging, and DNA damage in XPA gene knockout mice."Arch.Dermatol.Res.,. 292(10). 511-518 (2000)
• [文献書誌] Tanaka,M.: "Effects of photoreactivation of cyclobutane pyrimidine dimers and pyrimidine (6-4) pyrimidone photoproducts on ultraviolet mutagenesis in SOS-induced repair-deficient Escherichia coli."Mutagenesis,. 16(1). 1-6 (2001)
• [文献書誌] Wakasugi,M.: "DDB stimulates the excision of cyclobutane pyrimidine dimers in vitro in concert with XPA and RPA."J.Biol.Chem.,. (In press). (2001)