| 研究分担者 |
久保 喜平 大阪府立大学, 大学院・農学生命科学研究科, 教授 (40117619)
寺東 宏明 広島大学, 大学院・理学研究科, 助手 (00243543)
大山 義彦 広島大学, 大学院・理学研究科, 助教授 (30169081)
佐々本 一美 株式会社同仁化学, 研究所, 研究本部長
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| 研究概要 |
本研究では,DNA脱塩基部位選択的な標識法(ARP法),特定の損傷塩基を認識するDNAグリコシラーゼ処理,及びDNAアレイを組み合わせることにより,ゲノム全体にわたる遺伝子損傷分析法を開発するための基礎研究を行った。
ゲノム中の遺伝子単位で損傷を検出するためには,従来用いてきた発色法よりさらに高感度な検出法が必要である。ペルオキシダーゼ基質として化学発光試薬を用いることにより,10^6ヌクレオチドあたり1-2個の脱塩基部位が検出可能となった。次に,損傷塩基をARP検出可能な脱塩基部位に定量的に変換するためのDNAグリコシラーゼ処理条件を検討した。その結果,10^4ヌクレオチドあたりそれぞれ2.5個の酸化ピリミジン損傷及び酸化プリン損傷を含むDNA(10μg)では,Endo III(酸化ピリミジン損傷を認識),hOGG1(酸化プリン損傷を認識)共に,1μgの酵素と37℃で1時間インキュベートすることにより,損傷塩基を定量的に脱塩基部位に変換できることが分かった。さらに,ARP法とDNAアレイを組み合わせた損傷検出を行った。FASL, c-myc, XPB遺伝子(約1kb)をメンブレンに固定化しDNAアレイを作製した。10^4ヌクレオチドあたり1個の脱塩基部位を含むc-mycDNAを調製し,脱塩基部位をARP標識することにより,プローブDNAを作製した。条件IIを用いてプローブをDNAアレイにハイブリダイゼーションし,化学発光を検出した。DNAアレイのc-myc遺伝子に対しては強い化学発光が認められたが,FASL及びXPB遺伝子では認められなかった。以上の研究により。ARP法,DNAグリコシラーゼ処理,及びDNAアレイを組み合わせた遺伝子特異的なDNA損傷検出のための基礎技術が確立された。
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