区分標識法NMRと自由エネルギー計算による蛋白質阻害薬剤の迅速探索法の開発

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12558083
• 研究機関: 大阪大学
• 研究代表者: 中村 春木 大阪大学, たんぱく質研究所, 教授 (80134485)
• 研究分担者: 中井 孝尚 鐘淵化学工業(株), ライフサイエンスRDセンター高砂研究所, 基幹部員(研究職) ; 中島 伸介 大阪大学, たんぱく質研究所, 助手 (60324852) ; 山崎 俊夫 大阪大学, たんぱく質研究所, 助教授 (60273710) ; 守川 壮一 鐘淵化学工業(株), ライフサイエンスRDセンター高砂研究所, 主任(研究職)
• キーワード: 区分標識法NMR / インテイン / VanX酵素 / 自由エネルギー計算 / ドッキング / シミュレーション計算 / 分子認識 / ドラッグデザイン

研究概要

区分標識法NMRと自由エネルギー計算とを組み合わせ、溶液中での蛋白質・基質複合体の物理的・統計力学的に信頼性の高いモデルを作成する技術を確立し、蛋白質阻害薬剤開発の実用化をめざすことを目的とする。
昨年度までの基礎実験をもとに、本研究の具体的な応用ターゲットになりうる蛋白質および薬剤に関する調査を実施し、薬物設計の対象となりうる92種の酵素ファミリーを調査した結果、バンコマイシン(Vancomycin)耐性菌が持つD-alanyl-D-alanine Peptidase、通称VanX酵素が適当と判断した。VanX酵素は約200残基の蛋白質であり、その活性中心に1個の亜鉛イオンを含んでいる。NMR測定実験の対象として適当な大きさであり、大量発現系も知られている。X線結晶構造解析の報告があるが原子座標データはいまだ公開されていない。また、阻害剤も数種知られており、市販の阻害剤はないが化学合成が比較的容易な阻害剤としてD-Ala-D-Alaに類似した構造を持つ次亜リン酸化合物を選択し合成することができた(以上、鐘淵化学の分担)。
一方、VanX酵素を大腸菌中で発現させる系の構築を開始し、^<15>Nおよび^<13>C安定同位体で均一に標識したVanX酵素を大量に発現・採取することができた。特に^<15>Nで均一に標識したVanX酵素に合成した阻害剤を添加していくことにより、NMRスペクトルにおける化学シフトの変化が観測できた。
さらに、NMRによるSaturation Transfer法を利用した蛋白質複合体結合界面情報を、ドッキング・シミュレーションに利用する新たなアルゴリズムを考案し、CAD-ICADの系において実施し、その有効性を確認した(以上、大阪大学たんぱく質研究所の分担)。

研究成果

• [文献書誌] Higo, Junichi: "Energy landscape of a peptide consisting of alpha-helix,3(10)-helix, beta-turn, beta-hairpin, and other disordered conformations"Protein Science. vol.10,No.6. 1160-1171 (2001)
• [文献書誌] Higo, Junichi: "Energy landscape of a beta-hairpin peptide in explicit water studied by multicanonical molecular dynamics"Chemical Physics Letters. vol.377,No.1. 169-175 (2001)
• [文献書誌] Higo, Junichi: "Large vortex-like structure of dipole field in computer models of liquid water and dipole-bridge between biomolecules"Proceedings of National Academy of Science USA. vol.98,No.11. 5961-5964 (2001)
• [文献書誌] Furukawa, Koji: "A role of the third complementarity-determining region in the affinity maturation of an antibody"Journal of Biological Chemistry. vol.276,No.29. 27622-27628 (2001)
• [文献書誌] Kinoshita, Kengo: "Identification of protein functions from a molecular surface database, eF-site"Journal of Structural and Functional Genomics. vol.2,No.1. 9-22 (2001)
• [文献書誌] Ono, Satoshi: "Calibration of force-field dependency in free energy landscapes of peptide caonformations by quantum chemical calculations"Journal of Computational Chemistry. vol.23,No.4. 470-476 (2002)