複数の発光レポーターを用いた神経細胞機能の多元的リアルタイム計測システムの開発

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12558091
• 研究機関: 北海道大学
• 研究代表者: 本間 研一 北海道大学, 大学院・医学研究科, 教授 (40113625)
• 研究分担者: 久保田 英博 アトー株式会社, 技術開発部, 学術研究課長 ; 近江谷 克裕 静岡大学, 教育学部, 助教授 (20223951) ; 本間 さと 北海道大学, 大学院・医学研究科, 助教授 (20142713)
• キーワード: 生物発光 / 遺伝子転写 / 時計遺伝子 / 視交叉上核 / ルシフェラーゼ / 還流培養 / 多電極デッシュ

研究概要

1)遺伝子導入ベクターの作成
CMVおよび時計遺伝子Per1のプロモータ領域下流に波長特性の異なるホタルシフェラーゼ(非分泌型)あるいはウミボタル・ルシフェラーゼ(分泌型)を組み込んだベクターを構築した。まず、にNIH3T3培養細胞株にCMV・ルシフェレースを組み込んだ強制発現ベクターをトランスフェクトし、ルシフェレースの発光を確認した。また、Per1プロモーター・ルシフェレースを組み込んだベクターをCOS7培養株にBMAL1、Clock遺伝子発現ベクターとともにランスフェクトし、Per1プロモータが作動することを確認した。
2)超高感度光検出装置の開発
イメージインテンシファイアーとCCDカメラを結合し、コンピュータとインターフェースして、細胞内生物発光のリアルタイム測定装置プロトタイプを作成した。ルシフェレースをトランスフェトした10^6個の培養細胞から検出感度以上の発光がみられた。
3)多電極ディシュを装着した還流細胞培養系の開発
神経細胞の電気活動と遺伝子発現を同時に測定するために、分泌型ルシフェレースをレポーターとして遺伝子発現を経時的に測定する還流培養系を構築した。培養液中のルシフェレース蛋白量と発光量には良好な量・反応関係が認められた。また、フシフェレース蛋白の培養細胞からの放出を転写阻害剤、蛋白合成阻害剤など遺伝子転写から蛋白分泌にいたる各段階で作用する阻害剤を用いて抑制したところ、ルシフェレース発光量も時間的に平行して低下した。

研究成果

• [文献書誌] M.Ikeda, et al.: "cDNA Cloning of a novel bHLH-PAS transcription factor superfamily gene, BMAL2 : Its mRNA expression, subcellular distribution, and chromosomal localization."Biochem.Biophys.Res.Comm.. 261. 493-502 (2000)
• [文献書誌] T.Shirakawa,et al.: "Synchronization of circadian firing rhythms in cultured rat suprachiasmatic nucleus."Europ.J.Neurosci.. 12. 2833-2838 (2000)
• [文献書誌] S.Masubuchi, et al.: "Clock genes outside the suprachiasmatic nucleus involved in manifestation of locomotor activity rhythm in rats."Europ.J.Neurosci.. 12. 4206-4214 (2000)
• [文献書誌] M.Namihira, et al.: "Circadian pattern, light responsiveness and localization of clock gene, rPer1 and rPer2, expressions in the rat retina."NeuroReport,. 12. 471-475 (2001)
• [文献書誌] S.Honma, et al.: "Synaptic communication of cellular oscillations in the rat suprachiasmatic neurons."Neurosci.Lett.. 294. 113-116 (2000)
• [文献書誌] H.Abe, et al.: "Clock genes expressions in the suprachiasmatic nucleus and other areas of the brain during rhythm splitting in CS mice."Mol.Brain Res.. (2001)
• [文献書誌] Y.Tanahashi, et al.: "Continuous measurement of targeted promotor activity by a secreted bioluminescence reporter, Vargula hilgendorfii, luciferase."Anal Biochem,. (2001)