2001 年度実績報告書

複数の発光レポーターを用いた神経細胞機能の多元的リアルタイム計測システムの開発

研究課題

研究課題/領域番号	12558091
研究機関	北海道大学
研究代表者	本間研一北海道大学, 大学院・医学研究科, 教授 (40113625)
研究分担者	久保田英博アトー株式会社, 技術開発部, 学術研究課長(研究職) 近江谷克裕独立行政法人産業技術総合研究所, グループ長 (20223951) 本間さと北海道大学, 大学院・医学研究科, 助教授 (20142713)
キーワード	生物発光 / 遺伝子転写 / 時計遺伝子 / 視交叉上核 / ルシフェラーゼ / 還流培養 / 多電極デッシュ
研究概要	遺伝子導入ベクターの作成複数の時計関連遺伝子の転写活性を測定するために、時計遺伝子プロモータ領域を発光酵素遺伝子上流に挿入した生物発光レポーター遺伝子ベクターを構築した。まずmPer-1遺伝子上流8.1kbをPCR法によりクローンニングした。次に非分泌型発光酵素ウミホタルルシフェラーゼをpcDNA3にサブクローニングしたものに挿入しpYM104ベクターを構築した。BMAL,CLOCKタンパクよりmPer遺伝子を発現誘導させた場合、発光活性は2〜3倍に増加、pYM104ベクターがmPerの転写活性を可視化できることが確認できた。超高感度光検出装置の開発 1)絶対光量測定による新規発光定量法の開発 (I)光子数を計測するための装置を組み上げ、レーザー光を用いて校正。この装置で相対発光強度値から光子数へ換算するための「光子変換係数」を求めた。 (II)発光測定装置を校正するための発光標準溶液を用意し、(I)の装置で測定した。光子変換係数を用いることにより、この溶液が放出する光子数を求めた。 (III)発光測定装置の校正を(II)の溶液を用いて行い、この装置の光子変換係数を求めた。これにより、未知試料中のルシフェラーゼの分子数を定量化した。 2)生細胞を対象とした多色連続発光測定解析装置の開発複数タンパク転写活性領域を挿入した発光酵素遺伝子ベクターを作成、導入した生細胞内を、なるべくストレスを掛けない状況下に置いたまま、長時間に渡り、連続的に同時計測可能なシステムの構築を行った。計測システムである多色連続発光測定解析装置では冷却CCDカメラを基本に設計、構築した。本装置では細胞にストレスかけることなく連続的に転写活性を測定できることが確認できた。

研究成果
(7件)

すべてその他

すべて文献書誌 (7件)

[文献書誌] Y.Tanahashi, et al.: "Continuous measurement of targeted promotor activity by a secreted bioluminescence reporter, Vargula hilgendorfii, luciferase"Anal Biochem. 289. 260-266 (2001)
[文献書誌] M.Namihira, et al.: "Circadian pattern, light responsiveness and localization of clock gene, rPer1 and rPer2, expressions in the rat retina"NeuroReport. 12. 471-475 (2001)
[文献書誌] H.Abe, et al.: "Clock genes expressions in the suprachiasmatic nucleus and other areas of the brain during rhythm splitting in CS mice"Mol. Brain Res.. 87. 92-99 (2001)
[文献書誌] W.Nakamura, et al.: "Regional pacemakers composed of multiple oscillator neurons in the rat suprachiasmatic nucleus"Europ. J. Neurosci.. 14. 666-674 (2001)
[文献書誌] S.Masubuchi, et al.: "Circadian activity rhythm in methamphetamine-treated clock mutant mouse"Europ. J. Neurosci.. 14. 1177-1180 (2001)
[文献書誌] T.Shirakawa, et al.: "Multiple oscillators in the suprachiasmatic nucleus"Chronobiol. Int.. 18. 371-387 (2001)
[文献書誌] K.Honma, S.Honma: "Zeitgebers, Entrainment and Masking of the Circadian System"Hokkaido University Press. 1-299 (2001)

2001 年度 実績報告書

複数の発光レポーターを用いた神経細胞機能の多元的リアルタイム計測システムの開発

研究代表者

本間 研一 北海道大学, 大学院・医学研究科, 教授 (40113625)

研究成果

[文献書誌] Y.Tanahashi, et al.: "Continuous measurement of targeted promotor activity by a secreted bioluminescence reporter, Vargula hilgendorfii, luciferase"Anal Biochem. 289. 260-266 (2001)

[文献書誌] M.Namihira, et al.: "Circadian pattern, light responsiveness and localization of clock gene, rPer1 and rPer2, expressions in the rat retina"NeuroReport. 12. 471-475 (2001)

[文献書誌] H.Abe, et al.: "Clock genes expressions in the suprachiasmatic nucleus and other areas of the brain during rhythm splitting in CS mice"Mol. Brain Res.. 87. 92-99 (2001)

[文献書誌] W.Nakamura, et al.: "Regional pacemakers composed of multiple oscillator neurons in the rat suprachiasmatic nucleus"Europ. J. Neurosci.. 14. 666-674 (2001)

[文献書誌] S.Masubuchi, et al.: "Circadian activity rhythm in methamphetamine-treated clock mutant mouse"Europ. J. Neurosci.. 14. 1177-1180 (2001)

[文献書誌] T.Shirakawa, et al.: "Multiple oscillators in the suprachiasmatic nucleus"Chronobiol. Int.. 18. 371-387 (2001)

[文献書誌] K.Honma, S.Honma: "Zeitgebers, Entrainment and Masking of the Circadian System"Hokkaido University Press. 1-299 (2001)

2001 年度実績報告書

本間研一北海道大学, 大学院・医学研究科, 教授 (40113625)