| 研究課題/領域番号 |
12558091
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| 研究種目 |
基盤研究(B)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 展開研究 |
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| 研究分野 |
神経科学一般
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| 研究機関 | 北海道大学 |
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研究代表者 |
本間 研一 北海道大学, 大学院・医学研究科, 教授 (40113625)
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| 研究分担者 |
久保田 英博 アトー株式会社, 技術開発部・学術研究科, 課長(研究職)
近江谷 克裕 独立行政法人産業技術総合研究所, グループ長 (20223951)
本間 さと 北海道大学, 大学院・医学研究科, 助教授 (20142713)
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| 研究期間 (年度) |
2000 – 2001
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| キーワード | 生物発光 / 遺伝子転写 / 時計遺伝子 / 視交叉上核 / ルシフェラーゼ / 還流培養 / 多電極デッシュ |
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| 研究概要 |
1.多電極ディシュを装着した還流細胞培養系の開発 分泌型ルシフェレースをレポーターとして遺伝子発現を経時的に測定する還流培養系を構築した。培養液中のルシフェレース蛋白量と発光量には良好な量・反応関係が認められた。また、ルシフェレース蛋白の培養細胞からの放出を転写阻害剤、蛋白合成阻害剤など遺伝子転写から蛋白分泌にいたる各段階で作用する阻害剤を用いて抑制したところ、ルシフェレース発光量も時間的に平行して低下した。
2.遺伝子導入ベクターの作成 時計遺伝子プロモータ領域を発光酵素遺伝子上流に挿入した生物発光レポーター遺伝子ベクターを構築した。mPer-1遺伝子上流8.1kbをPCR法によりクローンニングし、また非分泌型発光酵素ウミホタルルシフェラーゼをpcDNA3にサブクローニングしたものに挿入して、pYM104ベクターを構築した。BMAL, CLOCKタンパクよりmPer遺伝子を発現誘導させ、発光活性の2〜3倍の増加、mPerの転写活性の可視化を確認した。
3.超高感度光検出装置の開発 1)絶対光量測定による新規発光定量法の開発 (I)レーザー光を用いて、相対発光強度値から光子数へ換算するための「光子変換係数」を求めた。
(II)前記光子変換係数を用いて、発光標準溶液が放出する光子数を求めた。
(III)前記発光標準溶液を用いて、未知試料中のルシフェラーゼの分子数を定量化した。
2)生細胞を対象とした多色連続発光測定解析装置の開発 複数タンパク転写活性領域を挿入した発光酵素遺伝子ベクターを作成、導入した生細胞内を、なるべくストレスを掛けない状況下に置いたまま、長時間に渡り、連続的に同時計測可能なシステムの構築を行った。計測システムである多色連続発光測定解析装置では冷却CCDカメラを基本に設計、構築した。本装置では細胞にストレスかけることなく連続的に転写活性を測定できることが確認できた。
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