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本年度は、以下のような研究を行うことにより、外来遺伝子の網膜細胞における非特異的発現系の作成、視細胞特異的発現のための発現調節領域の解析を行った。
1.再生網膜細胞での非特異的発現
まず、広範な活性を示すCMVプロモーターに、GFP遺伝子をつなぎ、カチオンリポソームとともに、成体イモリの網膜および網膜を除去したイモリの眼球内に導入した(リポフェクション)。レポーター遺伝子は、3日後、抗GFP抗血清によりGFPの発現を観察したところ、GFP遺伝子を導入していない網膜と比較して、有意なシグナルの増加が見られた。
2.転写調節因子のクローニング
イモリ網膜のcDNAより、Otx2・Rxをコードすると考えられる断片を単離した。それらのcDNA断片をプローブとして、イモリ成体網膜のcDNAライブラリーをスクリーニングした結果、Otx2とJunBのcDNAを単離することができた。残念ながら、これらには開始コドンがないため、現在翻訳領域全長を含むクローンの再スクリーニングを行っている。Otx2の発現を成体網膜で調べたところ、大部分の領域では網膜全層に弱く発現しているが、網膜の一部の領域では神経節細胞層に強く発現していることが観察された。さらに、再生過程の網膜と発生過程の網膜でのOtx2の発現を比較したところ、いずれも網膜全体に強く発現していることが明らかになった。これらのことから、Otx2が網膜の発生と再生や、層形成の維持に何らかの役割を果たしていることが示唆された。
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