微生物脱硫に関与する酵素系と遺伝子群の解析と応用

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12660078
• 研究機関: 鳥取大学
• 研究代表者: 大城 隆 鳥取大学, 工学部, 助手 (00233106)
• キーワード: Desulfurization / Dibenzothiophene / Flavin reductase / Rhodococcus

研究概要

我々が単離したRhodococcus erythropolis D-1株は微生物脱硫研究におけるモデル化合物であるジベンゾチオフェンを脱硫することができる。本菌株はDszC、DszA、DszBおよびフラビンレダクターゼの4つの酵素により脱硫反応を触媒する。今年度は、フラビンレダクターゼを本菌株から精製し、大腸菌内で高発現化してその性質を明らかにした。フラビンレダクターゼはDszCおよびDszAが触媒する酵素反応に必須な役割を果たす。本酵素をR.erythropolis D-1から精製し、比活性が無細胞抽出液に比べて660倍上昇した電気泳動的に単一な標品を得た。本酵素は四量体構造を有し、サブユニット分子量は22kDaであり、フラビンを補欠分子族として含有していなかった。電子供与体としてはNADHに対してのみ作用し、NADPHを基質とすることはできなかった。電子受容体に対する基質特異性も低くFMN以外にはわずかにFADを基質とすることができたが、活性は10%程度にとどまった。また、既知のフラビンレダクターゼが基質とすることができる芳香族ニトロ化合物に対する活性は有していなかった。本酵素の反応至適温度は35℃であったが、80℃で30分間処理した後も30%の活性を保持しており、熱安定性は高いと判断された。本菌株の全DNAを鋳型としたPCRにより本酵素遺伝子を増幅してクローニングを行い、大腸菌内で高発現化させた。その結果、無細胞抽出液中の本酵素の比活性は、R.erythropolis D-1に比べて275倍上昇し、可溶性タンパク質中の約3分の1を本酵素タンパク質が占めていた。脱硫微生物が生産するフラビンレダクターゼを詳細に明らかにしたのは今回が初めてであり、また、既知のフラビンレダクターゼとサブユニット構造や基質特異性の点で違いが認められるため、今後、構造研究への展開が期待される。

研究成果

• [文献書誌] T.Matsubara,T.Ohshiro,Y.Nishina,and Y.Izumi: "Purification, characterization, and overexpression of flavin reductase involved in dibenzothiophene desulfurization by Rhodococcus erythropolis D-1"Appl.Environ.Microbiol.. 67. 1179-1184 (2001)
• [文献書誌] T.Ohshiro and Y.Izumi: "Purification, characterization and crystallization of enzymes for dibenzothiophene desulfurization"Bioseparation. 9. 185-188 (2000)
• [文献書誌] Y.Ishii,T.Ohshiro,Y.Aoi,M.Suzuki,and Y.Izumi: "Identification of the gene encoding a NAD (P) H flavin reductase coupling with dibenzothiophene (DBT)-desulfurizing enzymes from the DBT-nondesulfurizing bacterium Paenibacillus polymyxa A-1"J.Biosci.Bioeng.. 90. 220-222 (2000)
• [文献書誌] Y.Furuya,H.Sawada,T.Hirahara,K.Ito,T.Ohshiro,Y.Izumi: "A Novel enzyme, L-tryptophan oxidase, from a basidiomycete, Coprinus sp.SF-1 : Purification and characterization"Biosci.Biotechnol.Biochem.. 64. 1486-1493 (2000)
• [文献書誌] 和泉好計,大城隆: "微生物による石油の脱硫-実用化プロセスに有用な代謝系と酵素-"酵素工学ニュース. 44. 9-14 (2000)