微生物脱硫に関与する酵素系と遺伝子群の解析と応用

2002 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12660078
• 研究機関: 鳥取大学
• 研究代表者: 大城 隆 鳥取大学, 工学部, 講師 (00233106)
• 研究分担者: 和泉 好計 鳥取大学, 工学部, 教授 (40026555)
• キーワード: Microbial desulfurization / Dibenzothiophene / Rhodococcus / Bacillus

研究概要

微生物脱硫プロセスは、実際の石油精製のプロセスにおいては高温高圧の条件下で実施する水素化脱硫のダウンストリームに位置すると想定されるため、できるだけ高温で実施するのが望ましい。このような観点から、55℃でも生育し、しかもジベンゾチオフェン(DBT)を脱硫可能なBacillus subtilis WU-S2Bが単離された。微生物脱硫は3段階の酵素反応からなるが、安定性が低く、律速段階になっている酵素は最終段階を触媒する、2'-ヒドロキシビフェニル2-スルフィン酸(HBPSi)デスルフィナーゼである。そこで、本年度はB.subtilis WU-S2B由来の本反応を触媒する酵素、BdsBについて研究を行った。
前年度、常温脱硫細菌、Rhodococcus erythropolis KA2-5-1由来の上記酵素(DszB)について研究を行ったが、この株からの酵素精製は困難であったため、分子シャペロンGroEL/GroESを共発現する大腸菌高発現株から酵素精製を行った経緯がある。BdsB遺伝子はすでにクローニングされ、塩基配列も明らかにされていたので、同様の方法で酵素精製を行い、電気泳動的に均一な標品を得た。BdsBとDszBとはその推定アミノ酸配列の相同性は70%程度である。本研究の結果、BdsBの最終比活性はDszBと同程度であった一方、HBPSiに対するKm値は164mMとなり、DszB(Km=8.2mM)より基質に対する親和性が低いという結果となった。その他の酵素化学的性質、蛋白質化学的性質はほとんど同一であった。ただ、BdsBは生成物アナログである2,2'-ジヒドロキシビフェニル存在下で熱安定性を測定すると、35℃、2時間の処理後も40%の残存活性を保持しており、非存在下では35℃で30分で失活することを考えると、生成物による安定化効果があるものと思われた。DszBにはこのような効果は全く認められなかった。しかしながら、処理温度を40℃にすると、BdsBにおいても安定化効果は見られなくなった。以上総合すると、触媒活性が高い分DszBの方がBdsBより脱硫酵素としては優れているものと判断された。

研究成果

• [文献書誌] N.NaKayama, T.Matsubara, T.Ohshiro, Y.Moroto, Y.Kawata, K.Koizumi, Y.Hirakawa, M.Suzuki, K.Maruhashi, Y.Izumi, R.Kurane: "A novel enzyme, 2'-hydroxybiphenyl-2-sulfinate desulfinase (DszB), from a dibenzothiophene-desulfurizing bacterium Rhodococcus erythropolis KA2-5-1 : gene overexpression and enzyme characterization"Biochim. Biophys. Acta. 1598. 122-130 (2002)
• [文献書誌] T.Ohshiro, Y.Aoi, K.Torii, Y.Izumi: "Flavin reductase coupling with two monooxygenases involved in dibenzothiophene desulfurization : purification and characterization from a non-desulfurizing bacterium, Paenibacillus polymyxa A-1"Appl. Microbiol. Biotechnol.. 59. 649-657 (2002)
• [文献書誌] O.Yoshikawa, Y.Ishii, K.Koizumi, T.Ohshiro, Y.Izumi, K.Maruhashi: "Enhancement and stabilization of desulfurization activity of Rhodococcus erythropolis KA2-5-1 by feeding ethanol and sulfur components"J. Biosci. Bioeng.. 94. 447-452 (2002)
• [文献書誌] T.Ohshiro, Y.Izumi: "Desulfurization of fossil fuels"Encyclopedia of Environmental Microbiology. 1041-1051 (2002)
• [文献書誌] T.Ohshiro, W.Hemrika, T.Aibara, R.Wever, Y.Izumi: "Expression of the vanadium-dependent bromoperoxidase gene from a marine macro-alga Corallina pilulifera in Saccharomyces cerevisiae and characterization of the recombinant enzyme"Phytochemistry. 60. 595-601 (2002)