赤潮プランクトン、シャットネラの活性酸素産生を司る酵素系の解析

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12660174
• 研究機関: 長崎大学
• 研究代表者: 小田 達也 長崎大学, 水産学部, 教授 (60145307)
• 研究分担者: 畠山 智充 長崎大学, 工学部, 助教授 (50228467) ; 石松 惇 長崎大学, 水産学部, 教授 (00184565)
• キーワード: 赤潮 / プランクトン / 活性酸素 / 毒性 / シャットネラ / ラフィド藻 / グリコキャッリックス / NADPH oxidase

研究概要

赤潮原因植物プランクトンであるChattonellaは通常の培養条件下で常にスーパーオキサイドを産生している一方で、レクチンの一種であるコンカナバリンA(Con A)、あるいは糖特異性が異なる他のレクチン(リシン、CBH、WGA等)添加によって、著しく上昇すること、さらに興味あることに、魚鰓粘液由来高分子物質にも同様な刺激作用があることを見出している。これらの結果からChattonellaにも、哺乳類白血球同様、細胞外からの刺激に応答してスーパーオキサイド産生量を増加させる刺激応答機構あるいは酵素系(NADPH oxidase)が存在すると推定される。さらに、Chattonella細胞表層に存在する糖皮膜構造体glycocalyxを含む無細胞粗抽出液中にNADPHを添加すると、スーパーオキサイドが酵素的に産生されることを見出した。そこで、本無細胞抽出液中に存在するHADPHに応答する酵素系について、特に白血球のNADPH oxidaseとの類似性について検討した。これまでの予備実験により、レクチン添加などの化学的刺激の他、穏和な条件下での撹拌や超音波処理などの物理的刺激によってもこのglycocalyxはChattonella細胞表層から脱落することをを見出している。そこで、Chattonella細胞を超音波処理あるいは単に軽度の撹拌処理した後、細胞本体を遠心分離により除去し、上清を得た。この上清にNADPHを添加するとスーパーオキサイドが酵素的に産生されることが確認されたので、これを粗酵素としてSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動によりその構成成分をさらに細かく分離後、常法に従い免疫抗体法によりウエスタンブロットによる解析を行った。すなわち、ヒト白血球由来NADPH oxidaseと免疫学的に類似した成分が存在するか調べた結果、ヒト好中球のNADPH oxidaseの主要成分蛋白質であるチトクロームb大サブユニット(gp91 phox)に対する抗体と反応する主要バンド(110kD)が検出された。また、本蛋白質をコードするDNA断片もChattonellaのゲノムDNAから検出された。以上の実験結果により、Chattonellaは哺乳類白血球細胞膜酵素であるNADPH oxidaseに類似したスーパーオキサイド産生を司る酵素系を有していることが強く示唆された。

研究成果

• [文献書誌] N.Sadakata, T.Oda, N.Komatsu, T.Muramatsu: "Effects of glutathione-related compounds on incresased caspase-3 and caspase-6-like activities in ricin-treated U937 cells"Biosci.Biotechnol.Biochem.. 64・1. 202-205 (2000)
• [文献書誌] D.Kim, T.Oda, A.Ishimatsu, T.Muramatsu: "Galacturonic-acid induced increase of superoxide production in red tide phytoplankton Chattonella marina and Heterosigma akashiwo"Biosci.Biotechnol.Biochem.. 64・4. 911-914 (2000)
• [文献書誌] Y.Matsubara, R.Kawata, K.Iwasaki, Y.Kimura, T.Oda, T.Muramatsu: "Cloning and sequence analysis of a gene(aly PG)encoding poly(a-L-guluronate)Iyase from Corynebacterium sp. Strain ALY-1"J.Biosci.Bioengineering. 89・2. 199-202 (2000)
• [文献書誌] T.Oda, N.Komatsu, T.Muramatsu, A.Nonaka, Suminto, K.Hirayama: "Detoxifying ability of marine bacterium Flavobacterium sp. against a toxic contaminant in the reagent sodium chloride to Nannochloropsis oculata"Fisheries Science. 66・2. 241-248 (2000)
• [文献書誌] T.Kawamura, T.Oda, T.Muramatsu: "Purification and characterization of a dipeptidyl carboxypeptidase from the polychaete Neanthes virens resmbling angiotensin I converting enzyme"Com.Biochem.Pysiol.. B126. 29-37 (2000)
• [文献書誌] N.Hasegawa, Y.Kimura, T.Oda, N.Komatsu, T.Muramatsu: "Isolated ricin B-chain-mediated apoptosis in U937 cells"Biosci.Biotechnol.Biochem.. 64・7. 1422-2000 (2000)
• [文献書誌] T.Okamoto, D.Kim, T.Oda, K.Matsuoka, A.Ishimatsu, T.Muramatsu: "Concanavalin A-induced discharge of glycocalyx of raphidophycean flagellates, Chattonella marina and Heterosigma akashiwo"Biosci.Biotechnol.Biochem.. 64・8. 1767-1770 (2000)
• [文献書誌] N.Komatsuo, M.Nakagawa, T.Oda, T.Muramatsu: "Depletion of intracellular NAD+ and ATP levels during ricin-induced apoptosis through the specific ribosomal inactivation results in the cytolysis of U937 cells"J.Biochem.. 128・3. 463-470 (2000)
• [文献書誌] T.Kawamura, K.Kikuno, T.Oda, T.Muramatsu: "Some molecular and inhibitory specifications of a dipeptidyl carboxypeptidase from the polychaete Neanthes virens resembling angiotensin I converting enzyme"Biosci.Biotechnol.Biochem.. 64・10. 2193-22000 (2000)
• [文献書誌] D.Kim, Y.Sato, T.Oda, T.Muramatsu, Y.Matsuyama, T.Honjo: "Specific toxic effect of dinoflagellate Heterocapsa circularisquama on the rotifer Brachionus plicatilis"Biosci.Biotechnol.Biochem.. 64・12. 2719-2722 (2000)
• [文献書誌] D.Kim, A.Nakamura, T.Okamoto, N.Komatsu, T.Oda, T.Iida, A.Ishimatsu, T.Muramatsu: "Mechanism of superoxide anion generation in the toxic red tide phytoplankton Chattonella marina : possible involvement of NAD(P)H oxidase"Biochim.Biophysi.Acta. 1524. 330-227 (2000)
• [文献書誌] Y.Iwamoto, R.Araki, K.Iriyama, T.Oda, H.Fukuda, S.Hayashida, T.Muramatsu: "Purification and characterization of bifunctional alginate lyase from Alteromonas sp.strain No.272 and its action on saturated oligomeric substrates"Biosci.Biotechnol.Biochem.. 65・1. 133-142 (2001)
• [文献書誌] T.Oda, Y.Sato, D.Kim, T.Muramatsu, Y.Matsuyama, T.Honjo: "Hemolytic activity of Heterocapsa circularisquama(dinophyceae) and its possible involvement in shellfish toxicity"J.Phycol.. 37. 509-516 (2001)
• [文献書誌] M.Miyazaki, J.Obata, Y.Iwamoto, T.Oda, T.Muramatsu: "Calcium-sensitive extracellular poly(a-L-guluronate)lyase from a marine bacterium Pseudomonas sp. strain F6 : Purification and some properties"Fisheries Sci.. 67. 956-964 (2001)
• [文献書誌] D.Kim, T.Okamoto, T.Oda, K.Tachibana, K.S.Lee, A.Ishimatsu, Y.Matsuyama, T.Honjo, T.Muramatsu: "Possible involvement of the glycocalyx in the ichthyotoxicity of Chattonella marina(Raphidophyceae): immunological approach using antiserum against cell surface structures of the flagellate"Mar.Biol.. 139. 625-632 (2001)