| 研究概要 |
本研究では、組換えDNA技術を用いて、魚類のSOD遺伝子並びにその5'-フランキング領域をクローニングしてその一次構造を決定し、分子レべルでの魚類SODの構造・機能並びにプロモーター領域を明らかにすること、更には、DNAプロープや本酵素を認識する特異抗体を利用することにより、魚類の酸化ストレス応答明らかにすることを目的とする。昨年度後半、ヒラメ肝膵臓より単離精製したCu, Zn-SOD及びMn-SODのN末端アミノ酸配列の情報に基づいてデザインしたプライマーを用いて、RT-PCR、RACE法により両SOD遺伝子のクローニングを行い、全一次構造を明らかにした。本年度は、GST-融合タンパク質発現系による両SOD遺伝子の大腸菌による高発現系の構築を行い、ヒラメCu, Zn-SODについては発現に成功した。更に再びヒラメにEdwardsiella tarda(代表的細菌感染症であるエドワジエラ症の病原細菌)を感染させ、その感染系を用いて病態の進行に伴うSODの挙動の変化を酵素活性及び特異抗体を用いたイムノブロット法による酵素量を指標として調べた。その結果、Mn-SODについては菌接種後1時間、3時間後において酵素活性及び酵素量の上昇が確認され、本酵素のE.tarda感染に伴う酵素的防御能の可能性が示唆された。現在は、cDNAフラグメントをプローブとして、ゲノムDNAからSOD遺伝子の5'-フランキング領域のクローニングを行っているところであり、両SOD遺伝子の発現調節部位を特定していく予定である。
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