| 研究課題/領域番号 |
12660250
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
応用動物科学
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| 研究機関 | 茨城大学 |
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研究代表者 |
金澤 卓弥 茨城大学, 農学部, 助手 (70272119)
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| 研究分担者 |
河本 馨 日本獣医畜産大学, 獣医畜産学部, 教授 (30011894)
小川 恭善 茨城大学, 農学部, 助教授 (00302331)
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| 研究期間 (年度) |
2000 – 2001
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| キーワード | 雄性生殖細胞 / 単クローン抗体 / 差次的遺伝子発現 / 哺乳動物 / 精巣 |
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| 研究概要 |
本研究は哺乳動物の雄性生殖細胞の増殖分化の過程で特異的に発現する遺伝子の探索ならびに雄性生殖細胞を同定するための単クローン抗体の作製および性状解析を行うことを目的とした。まず精細管構成細胞を特異的認識同定する抗体を作出するために、精子形成期のヤギ精巣から酵素消化法により組織構成細胞を分散し、これをマウスに免疫した。免疫したマウスから脾細胞を無菌的に取り出し、マウス骨髄腫細胞と細胞融合し、ハイブリドーマ細胞を作製した。まずエライザ法を用いて抗体産生ハイブリドーマを選択した。次に、精巣構成細胞を用いた免疫細胞染色を行い、陽性染色を示したハイブリドーマを選別し、限界希釈法を用いて陽性細胞をクローン化した。これら一連の方法により数千個のハイブリドーマコロニーからクローン性抗ヤギ精細管細胞抗体産生ハイブリドーマを樹立した。6種類の抗体産生ハイブリドーマから得た単クローン抗体を用いて精子形成期の精巣組織切片の免疫組織染色法を行い、それぞれの免疫染色の局在を調べた。また、同様に腎臓、肝臓、脾臓、精巣上体および心臓の各組織切片を用いて組織特異性を調べた。一方、精子形成期において特異的に発現する遺伝子を探索するために、精子形成開始前と精子形成開始後の雄ヤギから精巣を摘出し、それぞれの組織中より総RNAを定法により抽出した。これを鋳型として逆転写反応を行い、cDNA断片を作製した。さらにディファレンシャルディスプレー法により精子形成前後の時期において差次的に発現する遺伝子のcDNAを数十断片検出した。各々のcDNA断片を回収し、クローニングベクターに組み込んだ。その幾つかについて塩基配列を調べるとともに、ジゴキシゲニン標識cDNAを作製してドットブロットやノーザン解析を行うことにより精巣組織における特異的転写物を調べた。
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