| 研究課題/領域番号 |
12660261
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| 研究機関 | 近畿大学 |
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研究代表者 |
佐伯 和弘 近畿大学, 生物理工学部, 助教授 (10298937)
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| 研究分担者 |
松本 和也 近畿大学, 生物理工学部, 講師 (20298938)
細井 美彦 近畿大学, 生物理工学部, 助教授 (70192739)
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| キーワード | TGF8 / ウシ / 胚 / クローン / トランスフェクション / 体細胞 |
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| 研究概要 |
Transforming growth factor8(TGF8)遺伝子を破壊し筋肉を増大したウシを作製することを検討している。本年度は、1)体細胞への遺伝子導入方法の検討、2)クローンウシ作出技術の確立について検討した。
1)培養細胞への遺伝子導入方法の検討:培養細胞核への顕微注入法および薬剤によるトランスフェクションについて検討した。用いた遺伝子は、β act/luc+を含むプラスミドを用いた。細胞はウシ卵丘細胞を用いた。顕微注入ではコンフルエントな細胞(CC)および血清飢餓状態の細胞(SSC)の核内に遺伝子を注入した。その結果、CCでは遺伝子注入直後(15分後)から発現が認められ、その後24時間まで発現細胞は増加し約30%の細胞で認められた。一方SSCでは6時間後から発現が認められたものの24時間後でも10%と低率だった。しかしながらいずれの細胞も注入後120時間後には発現が認められず、注入24時間後までの発現は一過性の発現と思われた。薬剤によるトランスフェクションではCCにFuGENE6およびLipofectamine+で遺伝子導入を行った。その結果、導入遺伝子は、FuGENE6およびLipofectamine+でそれぞれ、0.1%および0.5%の細胞に安定的に組み込まれ、Lipofectamine+が効率的だった。現在、ウシ胎子繊維芽細胞を用いて遺伝子導入細胞のクローニングを試みている。
2)クローンウシ作出技術の確立:ウシ除核卵子に血清飢餓状態のウシ耳介から得た繊維芽細胞を電気融合しCa^<2+>イオノフォアとシクロヘキシミドで活性化してクローン胚を作製した。1015個の除核卵子と体細胞を融合した結果、604個が融合し72個の発育胚を得た。このうち20個の胚を10頭の受卵雌に移植したところ、2頭が妊娠した。そのうち1頭が正常に分娩した。これらのことからクローン技術により産子作出が可能であったが、その発育能は低かった。現在、胚発生率の向上のためクローン胚の活性化方法の改善について検討している。
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