| 研究課題/領域番号 |
12660289
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| 研究機関 | 酪農学園大学 |
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研究代表者 |
遠藤 大二 酪農学園大学, 獣医学部, 助教授 (40168828)
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| 研究分担者 |
昆 泰寛 北海道大学, 大学院・獣医学研究科, 助教授 (10178402)
桐沢 力雄 酪農学園大学, 獣医学部, 助教授 (70153252)
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| キーワード | サブトラクション / ヘルペスウイルス / RDA法 / マレック病ウイルス / ゲノム精製 / 牛ヘルペスウイルス1型 / 豚ヘルペスウイルス1型 / 馬ヘルペスウイルス1型 |
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| 研究概要 |
申請者らは、前年度においてマレック病ウイルス(MDV)感染細胞DNAから非感染細胞DNAをサブトラクションするRepresentational difference analysis(RDA)法によって、MDVの制限酵素切断断片を特異的に増幅する方法を確立した。この方法を用いることにより、MDVの野外株についても感染細胞プラークのクローニングを経ずに遺伝子の変異を検出することが可能と考えられた。つづけて、MDVゲノムの塩基配列の相違を、12,500bpの塩基配列を6種の株間で比較することにより推定した。Leeらが報告しているGA株(基準GA株)の塩基配列を基準とした場合、当研究室で継代されているGA、JM、Md5、MS2株およびRB-IB株は、基準株と2残基(GA株)、8残基(JM、Md5およびMS2株)、9残基(RB-IB株)または24残基(CVI-988株)が相違していた。すなわち、塩基配列の相違は0.5〜1.5kbpに一個であった。
これらの結果から、0.5〜1kbpの制限酵素切断断片を比較することにより、一段ペンあたり一個の突然変異を検出することが示唆された。0.5〜1kbpのゲノム断片を、哺乳動物のヘルペスウイルスから調製するため、DpnII切断された馬ヘルペスウイルス1型(EHV1)についてRDA法を実施した。EHV1では、MDVで実施されたと同じ方法では、ウイルスゲノム制限酵素切断断片の増幅に再現性が得られなかったため、RDA法によるサブトラクションを安定する目的で感染細胞由来DNAをDpnII切断された非感染細胞DNAの非特異的増幅産物によってサブトラクションをかけたところ、安定してウイルスゲノム制限酵素切断断片が増幅された。
これらの条件検討により、突然変異を検出するためのゲノム調製のための条件が整い、制限酵素切断断片あたり一個の突然変異を検出する条件が整えられた。
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