| 研究課題/領域番号 |
12660298
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| 研究種目 |
基盤研究(C)
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| 配分区分 | 補助金 |
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| 応募区分 | 一般 |
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| 研究分野 |
生物資源科学
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| 研究機関 | 関東学院大学 |
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研究代表者 |
丸山 肇子 (村山 肇子) 関東学院大学, 工学部, 教授 (10088883)
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| 研究分担者 |
宮嵜 厚 東北大学, 大学院・生命研究センター, 助手 (70219757)
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| 研究期間 (年度) |
2000 – 2002
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| キーワード | キチン / キトサン / ヒゲカビ / キチンデアセチラーゼ / PbCDA / PbCD / シグナルペプチド / 膜タンパク |
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| 研究概要 |
キトサンは医療、農業、工業など種々の分野で利用されている注目すべきバイオポリマーであり、利用範囲の広さにより年々その需要が高まっている。現在、工業的には缶詰工場などから出るカニの甲羅からキチンを精製し、キチンから化学的にキトサンに変えているが、その際に生じる高濃度アルカリの廃液が大きな問題である。しかし、これをchitin deacetylaseを用いて、酵素的に変換するのであれば、廃液の問題は解決する。そこで、我々は細胞壁の主成分がキチンとキトサンから成る接合菌類ヒゲカビのchitin deacetylase遺伝子をクローニングすることを計画した。
既にケカビchitin deacetylaseのクローンがKafezopoulosらにより報告されているが、このクローンのアセトアミド基を持つ多糖類のdeacetylaseとも共通なアミノ酸配列に対応するプライマーを作成し、ヒゲカビのゲノムDNAを鋳型としてPCRによりケカビのchitin deacetylase遺伝子と高い相同性を持つ218塩基対から成るDNA断片を合成した。この断片をプローブとしてヒゲカビcDNAライブラリーからポジティブクローンをスクリーニングした処、1種類のクローンのみが分離された。このクローンのコードするであろうタンパク質は451アミノ酸から成り、ケカビchitin deacetylaseと同様N-末端にシグナル配列とC-末端に膜結合配列を持ち、アミノ酸配列及び推定三次構造の相同生も高いことから、このタンパク質はヒゲカビのchitin deacetylaseであろうと考えられ、PbCDAと名付けた。クローンニングされた遺伝子はPbCDと名付けGenBankに登録した(accession #AB046690)。
これを工業的に利用するためには大腸菌など大量培養可能な微生物に遺伝子を導入し、大量に酵素を生産する必要がある。そこで、発現ベクターとしてNOVAGEN社のPET32 EK/LICにPbCDクロンを連結し、大腸菌に導入し、大腸菌抽出液からヒスチジンタグを持ったタンパク質分画として精製した。この分画にはクローンから発現したと思われるタンパク質の存在が確認されたが、酵素活性が検出されなかった。このクローンにより発現されるタンパク質g酵素活性をもつための条件を明らかにする事が我々の次のプロジェクトである。
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