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NIH3T3細胞に強制安定型発現させたラットクローン化ENaC(αβγrENaC)のチャネル活性が細胞内ATP(Km値が約1mM)により調節されること、(ii)このATPの効果はリン酸化などの水解反応を介さない非水解性ヌクレオチド結合を介する調節であることを明らかにしている。本年度はさらにこの調節機構が発現細胞に依存するか否かを明らかにするためにMDCK細胞にαβγrENaCを安定型強制発現させ実験を行ない、rENaC活性が細胞内ヌクレオチド結合を介して、細胞内ATPにより機能調節されるうることを示した。さらにこの調節機構の分子基盤を明らかにする目的でαβγrENaCに各々異なるタグを付加したサブユニットを安定型共発現するMDCK細胞を用いてATP結合実験を行なった結果、ATPはα-rENaCと結合することが明らかになった。これらの結果はrENaC活性は細胞内ATPがα-rENaCと結合することにより、機能調節をしている可能性を強く示唆する。
さらにαβγrENaC単独発現またはヒトCFTRとαβγrENaCを共発現させたNIH3T3細胞を用いて実験を行なった。ホールセルパッチクランプ法と単一チャネル記録法による実験で(i)両細胞に発現させたrENaCのイオン選択性、電位依存性、薬理学的性質、単一チャネルコンダクタンス等に電気生理学的性質、(ii)CFTRに関してはホールセルパッチクランプ法によりcAMP依存性チャネル活性化、陰イオン選択性、薬理学的性質などのCFTRの電気生理学的性質を確認した。今後、このようなrENaCおよびCFTR共発現系を用い上記のような細胞内ATP非水解性結合を介するrENaC調節機構がCFTRによるrENaC機能調節機構に関与するか否かを明らかにすることを目的として平成13年度も実験を継続する。
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