寒冷馴化ラット褐色脂肪UCPの卵細胞膜、糸粒体膜への発現に伴う細胞内イオン動態

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12670069
• 研究機関: 兵庫医科大学
• 研究代表者: 佐々木 貞雄 兵庫医科大学, 医学部, 助教授 (20104276)
• 研究分担者: 中垣 育子 兵庫医科大学, 医学部, 講師 (90084904) ; 辻田 純三 兵庫医科大学, 医学部, 講師 (30104235) ; 堀 清記 兵庫医科大学, 医学部, 教授 (80068452) ; 堀 和子 兵庫医科大学, 医学部, 助教授 (30068514)
• キーワード: 褐色脂肪細胞 / 寒冷馴化 / 細胞内イオン濃度 / UCP / 熱産生 / 免疫電顕法

研究概要

1、寒冷および温暖順化ラットを飼育し、その代謝機能を測定した後、褐色脂肪組織を採取した。
2、アフリカツメガエル(Xenopus)を飼育し、受精卵を採取した。
3、採取した褐色脂肪組織より核酸分画を調製し、全リボ核酸分画よりミトコンドリアの非共役、熱産生蛋白サーモジェニン(UCP:uncoupling protein)の相補的遺伝子の転写産物を得た。
4、UCP遺伝子の転写産物のXenopus oocyteへの注入を行い、共焦点レーザー顕微鏡で観察しつつパッチおよびホールセルクランプ法を適用し、Ca^<2+>感受性色素(fluo-3)でCa^<2+>濃度を、H^+勾配提示色素(アクリダイオレンジ)でH^+勾配を測定しつつK^+やC^<1->電流を測定し、熱産生亢進時の非共役熱産生蛋白をめぐるイオン動態を明らかにした。
5、UCP遺伝子転写産物を注入発現させたXenopus oocyteを凍結しその凍結切片を電子プローブX線微小部分析法に供し、非共役発熱蛋白の活動時の細胞膜および内膜系を介してのイオン、元素動態を明らかにした。同時にそのoocyteにUCPの標識(酵素および蛍光)抗体を注入し、一部のoocyteは免疫電顕用の固定包埋を行い、他の一部はそのまま共焦点レーザー顕微鏡で観察し、UCP発現の正確な位置関係を明らかにした。この免疫組織細胞化学的手法を褐色脂肪細胞にも適用し、褐色脂肪細胞の糸粒体内膜へUCPが核、細胞質で転写、翻訳された後、如何にソーティング、インサーティングされるのか、またその時細胞内のCaを初めとするイオンは如何に関与するかを光学顕微鏡、電子顕微鏡さらに細胞分画法をも援用して検討した。Cambridge大の近藤久雄は細胞分画法の業績と設備に恵まれており細胞内小器官での免疫電顕法を依頼した。

研究成果

• [文献書誌] 佐々木貞雄,蔡桜蘭,中垣育子 その他: "寒冷馴化時の褐色脂肪細胞熱産生蛋白のミトコンドリア内膜への誘導"第77回日本生理学会大会予稿集. 110 (2000)
• [文献書誌] 蔡桜蘭,佐々木貞雄,中垣育子 その他: "寒冷馴化肥満ラットの褐色細胞内イオン動態と呼吸商の測定"第39回日本生気象学会雑誌. 37(3). S78 (2000)
• [文献書誌] Nakagaki,I,Sasaki,S.,Hori,S.Kondo,H.: "Ca2+ and electrolyte mobilization following agonist application to the pancreatic B cell line HIT."Pflugers Archiv . 440. 828-834 (2000)
• [文献書誌] Sasaki,S.,Tsai,Y.,Nakagaki,I.,Yahata,T.,Konoh,N.,Hori,S.& Kuroshima,A.: "Changes ofion environment during UCP induction in rat brown adipoctytes."Jph.J.Physiol.. 49(suppl). S231 (1999)
• [文献書誌] 中垣育子,蔡桜蘭,佐々木貞雄 その他: "寒冷馴化ラット褐色脂肪細胞の熱産生蛋白誘導にともなうイオン動態"日本生気象学会雑誌. 35(3). S44 (1999)
• [文献書誌] Sasaki,S.,Nakagaki,I.,Hori,S.,Kondo,H.& Sakaguchi,B.: "Intracellular electrolyte levels and transport of secretory granules in exocrine gland cells."J.Exp.Biol.. 201. 1273-1281 (1998)