寒冷馴化ラット褐色脂肪UCPの卵細胞膜、糸粒体膜への発現に伴う細胞内イオン動態

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12670069
• 研究機関: 兵庫医科大学
• 研究代表者: 佐々木 貞雄 兵庫医科大学, 医学部, 助教授 (20104276)
• 研究分担者: 中垣 育子 兵庫医科大学, 医学部, 講師 (90084904) ; 辻田 純三 兵庫医科大学, 医学部, 講師 (30104235) ; 堀 清記 兵庫医科大学, 医学部, 教授 (80068452) ; 堀 和子 兵庫医科大学, 医学部, 助教授 (30068514)
• キーワード: 褐色脂肪細胞 / 寒冷馴化 / 細胞内イオン濃度 / UCP / 熱産生 / 免疫電顕法 / ハイブリダイゼーション

研究概要

1、寒冷および温暖順化ラットを飼育し、その代謝機能を測定した後、褐色脂肪組織を採取した。
2、アフリカツメガェル(Xenopus)を飼育し、受精卵を採取した。
3、採取した褐色脂肪組織より核酸分画を調製し、全リボ核酸分画よりミトコンドリアの非共役、熱産生蛋白サーモジェニン(UCP : uncoupling protein)の相補的遺伝子の転写産物を得た。
4、UCP遺伝子の転写産物のXenopus oocyteへの注入を行い、共焦点レーザー顕微鏡で観察しつつパッチおよびホールセルクランプ法を適用し、Ca^<2+>感受性色素(fIuo-3)でCa^<2+>濃度を、H^+勾配提示色素(アタリダイオレンジ)でH^+勾配を測定しつつK^+やCl^-電流を測定し、熱産生亢進時の非共役熱産生蛋白をめぐるイオン動態を明らかにした。
5、UCP遺伝子転写産物を注入発現させたXenopus oocyteを凍結しその凍結切片を電子プローブX線微小部分析法に供し、非共役発熱蛋白の活動時の細胞膜および内膜系を介してのイオン、元素動態を明らかにした。同時にそのoocyteにUCPの標識(酵素および蛍光)抗体を注入し、一部のoocyteは免疫電顕用の固定包埋を行い、他の一部はそのまま共焦点レーザー顕微鏡で観察し、UCP発現の正確な位置関係を明らかにした。この免疫組織細胞化学的手法を褐色脂肪細胞にも適用し、褐色脂肪細胞の糸粒体内膜へUCPが核、細胞質で転写、翻訳された後、如何にソーティング、インサーテイングされるのか、またその時細胞内のCaを初めとするイオンは如何に関与するかを電顕法、細胞分画法を援用して検討した。
6、寒冷馴化時のUCPの発現はラットUCPの遺伝子のどのサブクラスが転写されたのかをPCR法やDNAマイクロアレイ法などを用いて検討した。

研究成果

• [文献書誌] Tsai YL, Sasaki S, Nakagaki I, Tsujita J, Hori S, Hori K: "Ion transport and morphological changes of mitocondria in brown adipocytes of warm-and cold-acclimated obese zucker rats"Jpn J Physiol. 51. 531-537 (2001)
• [文献書誌] Nakagaki I, Tsai YL, Sasaki S, Hori S, Kondo H: "Effects of cold acclimation for mitochondrial ion transport activity in brown adiocytes"Jpn J Physiol. 51(Suppl). S271 (2001)
• [文献書誌] Sasaki S, Tsai YL, Nakagaki I, Kanoh N, Hori S: "UCP induction on the inner mitochondrial membrane in cold acclimated rat brown adipocytes"Jpn J Physiol. 50(Suppl). S225 (2000)
• [文献書誌] Nakagaki I, Sasaki S, Hori S, Kondo H: "Ca2+ and electrolyte mobilization following agonist application to the pancreatic B cell line HIT"Pflugers Archiv. 440. 828-834 (2000)
• [文献書誌] Sasaki S, Tsai YL, Nakagaki I, Yahata T, Kanoh N, Hori S, Kuroshima A: "Changes of ion environment during UCP induction in rat brown adipocytes"Jpn J Physiol. 49(Suppl). S231 (1999)
• [文献書誌] Sasaki S, Nakagaki I, Hori S, Kondo H, SaKaguchi B: "Intracellular electrolyte levels and transport of secretory granules in exocrine gland cells"J Exp Biol. 201. 1273-1281 (1998)