Caによる細胞膜Naチャネル発現調節機序:サブユニットmRNA変動と細胞内輸送

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12670092
• 研究機関: 宮崎医科大学
• 研究代表者: 和田 明彦 宮崎医科大学, 医学部, 教授 (30131949)
• 研究分担者: 柳田 俊彦 宮崎医科大学, 医学部, 助手 (60295227) ; 上園 保仁 長崎大学, 医学部, 講師 (20213340) ; 小林 英幸 宮崎医科大学, 医学部, 助教授 (40148953)
• キーワード: Voltage-dependent sodium channels / Up-and down-regulation / Calcium / Protein kinase C / Calpain / Calcineurin / Ca-ATPase / Neuroprotective drug

研究概要

ウシ副腎髄質クロマフィン細胞(発生学的に神経堤に由来する)の培養系において、虚血・低酸素による細胞障害に関与する細胞内Caシグナル伝達系や神経保護薬が、Naチャネル遺伝子の細胞膜発現に対して、どのような影響を与えるか、3H-サキシトキシン結合、細胞内への22Na流入、ウエスタン・ブロット、ノザン・ブロット、細胞内[Ca]_iやカルシニューリン活性測定などにより、解析した。
1.[Ca]_iによる細胞膜Naチャネルdown-regulation-[Ca]_i上昇パターンの違いによるmultipleな機序:Caイオノフォア、小胞体Ca-ATPase阻害薬(タプシガルギン、DBHQ)により、(1)中程度・比較的長期の[Ca]_i上昇は、conventional protein kinase C-αやカルパインを活性化することにより、Naチャネルの細胞内へのinternalizationを促進し、また、(2)さらに高濃度・持続的[Ca]_i上昇は、Naチャネルα-およびβ_1-サブユニットmRNAレベルを低下させ、いづれの[Ca]_i上昇も細胞膜Naチャネル量のdown-regulationをおこした;(3)down-regulaitonされたNaチャネルにおいて、22Na流入量は低下したが、ネイティブNaチャネルと同様、ヴェラトリジン、α-およびβ-サソリ毒、ブレベトキシンによるアロステリックなチャネル開孔機構は保持されていた;他方、(4)急速・一過性[Ca]_i上昇は、Naチャネルdown-regulationをおこさなかった。
2.カルシニューリンによるNaチャネル細胞内輸送:サイクロスポリンA、FK506は、カルシニューリン活性を阻害し、トキシンによるアロステリック開孔機構を示すNaチャネルの細胞膜発現量をup-regulaitonした。これは、Naチャネルのtrans-Golgi networkからのexternalizationの促進とNaチャネルinternalization低下によるものであり、Naチャネル蛋白やNaチャネル・サブユニットmRNAの細胞レベルは変動しなかった。Naチャネルup-regulationにより、Caチャネル開孔・カテコールアミン分泌は増強された。
3.神経保護薬NS-7のNaチャネルへの短期および長期効果:NS-7は、Naチャネルα-サブユニットのドメインIのトランス・メンブレン・セグメント6に結合し、Naチャネル開孔を可逆的に阻害し、Caチャネル開孔・カテコールアミン分泌を低下させた。他方、NS-7の慢性投与は、細胞膜Naチャネル量をup-regulationした。up-regulation機序は、カルシニューリンのそれと類似していた。しかし、lipophilicなNS-7は、Naチャネル、および、その近傍の細胞膜脂質に非可逆的に結合しており、22Na流入量は、むしろ、低下した。アロステリック開孔機構は阻害されなかった。また、NS-7の急性投与は、ニコチン受容体のイオン・チャネル開孔を、抑制した。

研究成果

• [文献書誌] Toshihiko Yanagita et al.: "Protein Kinase C-α and-ε down-regulate cell surface sodium channels via differential mechanisms in adrenal chromaffin cells."Journal of Neurochemistry. 74・4. 1674-1684 (2000)
• [文献書誌] Hiroki Yokoo et al.: "Short-and long-term differential effects of neuroprotective drug NS-7 on voltage-dependent sodium channels in adrenal chromaffin cells."British Journal of Pharmacology. 131・4. 779-787 (2000)
• [文献書誌] Hiroki Yokoo et al.: "Inhibition by neuroprotective drug NS-7 of nicotine-induced ^<22>Na^+ influx, ^<45>Ca^<2+> influx and catecholamine secretion in adrenal chromaffin cells."Brain Research. 873. 149-154 (2000)
• [文献書誌] Seiji Shiraishi et al.: "Heterogeneous increases of cytoplasmic calcium : distinct effects on down-regulation of cell surface sodium channels and sodium channels subunit mRNA levels."British Journal of Pharmacology. (accepted for publication on January 19,2001).
• [文献書誌] Seiji Shiraisdi et al.: "Up-regulation of cell surface sodium channels by cyclosporin A, FK506 and rapamycin in adrenal chromaffin cells."Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. (accepted for publication on January 31,2001).
• [文献書誌] Seiji Shiraishi et al.: "Immunophilin ligands upregulate voltage-dependent Na^+ channels in cultured bovine adrenal chromaffin cells."Japanese Journal of Pharmacology. 82(Suppl I). 141 (2000)