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本研究は、マラリア原虫の赤血球への侵入型であるメロゾイトの先端部に局在し、侵入に重要な役割を果たすと考えられているロプトリー蛋白(140kDaおよび100kDa)の機能解析を、ジーンターゲティングの手法を用いて解析することを目的として実施している。今年度は、これらの遺伝子座を破壊したノックアウト原虫を作成することを試みた。140kDaロプトリー蛋白の遺伝子座破壊ベクターを構築するために、PCR法によりネズミマラリア原虫Plasmodium yoeliiから140kDaロプトリー蛋白をコードする遺伝子断片を増幅し、ピリメサミン耐性遺伝子を運ぶベクターpMD204に組み込んだ。遺伝子断片を組み込んだベクターの塩基配列を解析し、予定していたベクターが構築されていることを確認した。ネズミマラリア原虫P.yoeliiの100-kDaロプトリー蛋白についても、同様の操作を行った。
遺伝子の破壊を予定しているネズミマラリア原虫P.yoeliiにおいては、現在のところ、遺伝子導入方法が確立していないため、近縁種のP.bergheiで確立されている方法を基に、1)実験に使用するマウス体内における原虫のピリメサミン感受性の確認、および、2)ピリメサミン耐性遺伝子の遺伝子導入による薬剤耐性能の獲得の確認とピリメサミンの有効濃度の確認などの予備実験を行った。その結果、P.yoeliiでもP.bergheiと同様の方法で遺伝子導入が可能であることが示唆された。現在、直鎖状にした140kDaロプトリー蛋白の遺伝子座破壊ベクターをP.yoeliiに電気穿孔法により遺伝子導入し、ピリメサミンの選択圧の下で培養して、ロプトリー蛋白遺伝子座が破壊された原虫の選択を試みている。
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