赤痢アメーバの表面レクチンに対する人工ヒト抗体の作製と応用

2000 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12670242
• 研究機関: 東海大学
• 研究代表者: 橘 裕司 東海大学, 医学部, 助教授 (10147168)
• キーワード: 赤痢アメーバ / ヒトモノクローナル抗体 / レクチン / 無症候性嚢子排出者 / 抗体遺伝子

研究概要

赤痢アメーバに感染していながら症状を呈さない無症候性嚢子排出者は、有症者ほど高い血清抗体価を示さないものの、赤痢アメーバの腸粘膜への侵襲を防御できる抗体を保有している可能性が高い。そこで、無症候性嚢子排出者由来の抗赤痢アメーバヒトモノクローナル抗体の作製を試みた。末梢血液約10mlからリンパ球を分離してRNAを精製し、抗体のL鎖とH鎖Fd領域をコードする遺伝子をRT-PCRで増幅した。これらの遺伝子断片を発現ベクターに組み込み、大腸菌に導入してライブラリーを作製した。約6×10^4個のクローンをコロニーブロット法でスクリーニングし、6個の陽性クローンを得た。さらに間接蛍光抗体法を用いて2次スクリーニングを行い、虫体表面と反応する1クローン(CP33)を選別した。抗体遺伝子の塩基配列を決定し、予想されるアミノ酸配列を既知の配列と比較したところ、CP33のL鎖V領域はVκ1、H鎖V領域はMISCに分類された。また、CP33が認識する抗原は赤痢アメーバに特異的な260-kDaのGal/GalNAcレクチンであることが明らかになった。次に、CP33を基にして、L鎖とH鎖のよりよい組み合わせの検索を試みた。その方法として、CP33のL鎖、H鎖遺伝子のそれぞれについて、他方をライブラリーの遺伝子とreshufflingし、再スクリーニングを行った。その結果、新たに70個以上の陽性クローンが得られた。アミノ酸配列の異なるクローンについて、赤痢アメーバ抗原に対する反応性をELISAで比較したところ、L鎖遺伝子をreshufflingして得られた少なくとも2クローンが、CP33よりも高い値を示した。このような方法を用いることで、抗体価の低い感染者のリンパ球からも、病原体に特異的なヒトモノクローナル抗体の作製が可能であることが明らかになった。

研究成果

• [文献書誌] Cheng,X.-J. et al.: "Entamoeba histolytica : Bacterial expression of a human monoclonal antibody which inhibits in vitro adherence of trophozoites."Exp.Parasitol.. 96(1). 52-56 (2000)
• [文献書誌] Tachibana,H. et al.: "Entamoeba dispar, but not E. histolytica, detected in a colony of chimpanzees in Japan."Parasitol.Res.. 86(7). 537-541 (2000)
• [文献書誌] Cheng,X.-J. et al.: "Molecular cloning and characterization of peroxiredoxin from Entamoeba moshkovskii."Arch.Med.Res.. 31(4,Suppl.). S65-S66 (2000)
• [文献書誌] Cheng,X.-J. et al.: "Bacterial expression of a human monoclonal antibody that inhibits in vitro adherence of Entamoeba histolytica trophozoites."Arch.Med.Res.. 31(4,Suppl.). S311-S312 (2000)
• [文献書誌] Tachibana,H. et al.: "High prevalence of infection with Entamoebadispar, but not E.histolytica, in captive macaques."Parasitol.Res.. 87(1). 14-17 (2001)
• [文献書誌] Cheng,X.-J. et al.: "Protection of hamsters from amebic liver abscess formation by immunization with the 150-and 170-kDa surface antigens of Entamoeba histolytica."Parasitol.Res.. 87(印刷中). (2001)