| 研究概要 |
マウス腎の年齢依存性発現タンパク質M-LPに関する研究
1.M-LPの膜トポロジーの解析
MLP-GFPを導入・発現させたCOS-7細胞より調製した膜画分および可溶性画分を、電気泳動によって分離し、抗GFP特異抗体を用いてMLP-GFPの検出を行った。MLP-GFPに相当するバンドは膜画分のみに認められたことから、M-LPはペルオキシソーム膜に局在していることが示された。
次に、N末端をflagでC末端をmycでそれぞれ標識したM-LP(Flag-MLP-Myc)を導入・発現させたCOS-7細胞に膜透過処理を施し、抗flag、抗myc、抗CATまたは抗PMP70特異抗体を用いて免疫蛍光染色を行った。その結果、M-LPのN末端とC末端がいずれもペルオキシソーム膜の外側(細胞質側)にあることが示された。アミノ酸配列に基づく疎水性分析の結果から、M-LPは4つの膜貫通領域(amino acid positions 15-34,51-67,92-110,151-168)、膜貫通領域をつなぐ3つのループ、および細胞質側に突き出したN末端とC末端より構成されているものと考えられた。
2.M-LP mRNAの選択的スプライシング産物の同定
M-LPのRACE産物をさらに精査した結果、M-LPのC末端側の90アミノ酸をコードする新しいスプライシング産物を同定した。そこで、従来の194アミノ酸よりなるM-LPをM-LP_L、M-LPのC末端側90アミノ酸よりなるタンパク質をM-LP_Sと命名した。GFP標識M-LP_Sの遺伝子をCOS-7細胞内で発現させて蛍光を観察した結果、MLP_S-GFPはペルオキシソームではなく細胞質に局在していることが示された。
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