ミトコンドリア血管症の病態機序の解明と遺伝子導入による機能修復

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12670598
• 研究機関: 福井医科大学
• 研究代表者: 米田 誠 福井医科大学, 医学部・附属病院, 講師 (70270551)
• 研究分担者: 栗山 勝 福井医科大学, 医学部, 教授 (80107870)
• キーワード: ミトコンドリア血管症 / ミトコンドリア遺伝子変異 / mtDNA欠損株 / MELAS症候群 / ヒト脳血管内皮細胞

研究概要

脳卒中様発作を主張とするミトコンドリア脳筋症のひとつであるMELAS症候群(ミトコンドリア遺伝子[mtDNA]の塩基番号3243位のアデニンからグアニンへの点突然変異)の病因mtDNAを導入した血管内皮細胞培養系を構築するため以下を行った.
1.mtDNA欠損株の構築のための条件設定
ヒト脳細動脈内皮細胞の初代培養株(BME;大日本製薬)を様々な濃度(10ng/ml〜200ng/ml)のエチジウムブロミド(EtBr)を培地に添加し,最も高率にmtDNAを選択的に消失し,生存も可能である条件を検討した.mtDNA断片をプローブとして(核ribosomal DNA遺伝子を内部標準),サザンブロットを行った結果,50ng/ml濃度が最も適切であることが判明した.この条件下で,mtDNAの量はEtBr添加前の値に比べ,60.5%(3日), 31.3%(6日), 5.6%(9日)で約2週間でほぼ検出感度以下まで減少することが明らかとなった.
2.MELAS患者由来の血小板mtDNAの血管内皮細胞への導入
福井医科大学附属病院へ通院する3名のMELAS患者から,同意を得た上で採血し,パーコール法で血小板(mtDNAのみを有する)を単離し,ヒト脳細動脈内皮細胞の初代培養株BMEへ細胞融合法によって導入した.この段階での融合細胞には,患者由来の変異型mtDNAと野生型mtDNAが混在するため,Kingらの方法(Methods Enzymol. Vol.264)にのっとり,(1)の条件で融合細胞をEtBr処理することでmtDNAの量を極端に減少させ,その後,EtBrを取り除くことで,効率良く,短時間で変異型もしくは野生型mtDNAのみを有する細胞株を得ることができた.
本年度は,これらの細胞株を用いて,好気的エネルギー代謝(酸素消費量,ATP量)と血管透過性を検討する.

研究成果

• [文献書誌] Yoshida, K, Yamazaki, H, Ozeki, T, Inoue, T, Yoshioka, Y, Yoneda, M.et al.: "Mitochondrial genotypes and radiation-induced micronucleus formation in human osteosarcoma cell in vitro"Oncology Report. 53. 615-619 (2001)
• [文献書誌] Sahashi, K, Yoneda, M, Ohno, K, Tanaka, M, Sahashi, K: "Functional characterization of mitochondrial tRNA-Tyr muration(5877G-A)assocaited with familial chronic progressive ophthalmoplegia"J Med Genet. 38. 703-705 (2001)
• [文献書誌] 米田誠: "「新ミトコンドリア学」内海耕造,井上正康(編)"共立出版.東京. 10 (2001)