von Willebrand因子・血小板相互作用の制御機構の解析

2001 年度 実績報告書

• 研究課題/領域番号: 12670983
• 研究機関: 名古屋大学
• 研究代表者: 松下 正 名古屋大学, 医学部・附属病院, 助手 (30314008)
• 研究分担者: 小嶋 哲人 名古屋大学, 医学部, 教授 (40161913)
• キーワード: von Willebrand factor / GPIb / Polymerase chain reaction / platelet / thrombosis / coronay heart disease / alanine scanning mutagenesis

研究概要

1)研究の目的
本研究ではvon Willebrand因子(以下VWF)と血小板膜糖蛋白GPIbの結合におけるVWFのコンフォメーション変化の本体を明らかにすることにより、血栓症発症のメカニズム、さらにはコントロール・治療に結びつく知見を得ようとするものである。
2)平成12年度
Flanking regionの各領域、459-508,475-508,497-508,696-709,459-508+696-709,475-508+696-709,497-508+696-709を欠失させたmutantをPCR法を応用して作成した。発現プラスミドを293T細胞に発現させ、良好な発現を得た。Mutantが正しい蛋白コンフォメーションをとっているかどうかをモノクローナル抗体パネルを確認した。
4)平成13年度
mutant蛋白質のGPIbへの結合能を、ristocetinおよびbotrocetinの存在下で検討、併せてモジュレーター非存在下での結合を検討した。497-508、696-709を欠損したものとR545のDouble mutantでは興味深いことに通常見られないモジュレーター非存在下での結合が出現した。以上のことより、VWF-GPIb反応の制御は、S-S結合ループ外側の領域とType2B領域との協調により成立していると考えられた。次にこの結合に対して抗VWF抗体NMC4,Avw3が阻害を示し、結合がGPIb依存性のものであることを確認した。さらにFlanking regionの一部である505-506と539-543にエピトープを持つ3つの抗VWF抗体B328,B710,23C4の、696-709欠損Double mutantに対する阻害能が確認できた。Emsleyらによる1998年に発表されたhuman VWFの結晶構造モデルを用いて解析したところこれらの抗体はN末端armのcornerに結合することによってVWFのコンフォメーション変化にロックをかけていると考えられた。

研究成果

• [文献書誌] K. Ishiguro, T. Matsushita, etal: "Syndecan-4 deficiency leads to high mortality of lipopolysaccharide-injected mice"J Biol Chem. 276. 47483-47488 (2001)
• [文献書誌] T. Iwaki, T. Mastushita, etal: "DNA sequence analysis of protein S deficiency--identification of four point mutations in twelve Japanese subjects"Semin Thromb Hemost. 27. 155-160 (2001)
• [文献書誌] T. Kojima, T. Matsushita, etal: "Plasma levels of syndecan-4 (ryudocan) are elevated in patients with acute myocardial infarction"Thromb Haemost. 85. 793-799 (2001)
• [文献書誌] S. Kunishima, T. Matsushita, etal: "Mutations in the NMMHC-A gene cause autosomal dominant macrothrombocytopenia with leukocyte inclusions (May-Hegglin anomaly/Sebastian syndrome)"Blood. 97. 1147-1149 (2001)
• [文献書誌] S. Kunishima, T. Matsushita, etal: "Identification of six novel MYH9 mutations and genotype-phenotype relationships in autosomal dominant macrothrombocytopenia with leukocyte inclusions"J. Hum. Genet. 46. 722-729 (2001)
• [文献書誌] M. Yanada, T. Matsushita, etal: "Impact of antithrombin deficiency in thrombogenesis : lipopolysaccharide and stress-induced thrombus formation in heterozygous antithrombin-deficient mice"Blood. (in press).