| 研究課題/領域番号 |
12670985
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| 研究機関 | 大阪大学 |
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研究代表者 |
待井 隆志 大阪大学, 医学系研究科, 助教授 (50124780)
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| 研究分担者 |
金倉 譲 大阪大学, 医学系研究科, 教授 (20177489)
池田 弘和 大阪大学, 医学系研究科, 助手 (10311755)
柴山 浩彦 大阪大学, 医学部附属病院, 医員
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| キーワード | PNH / PIG-A遺伝子 / GPIアンカー / 造血幹細胞 / CD59 / レトロウイルスベクター |
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| 研究概要 |
1.初期のPIG-A遺伝子の解析から6-10年経過しているPNH症例4例(2例はオリゴクローン)について再度遺伝子解析を行った。その結果、いずれの症例においても初期の変異クローンが現在も優勢クローンとして存在していることが示された。この成績は1個のPNH幹細胞クローンが交代することなく長期にわたって造血を維持しうることを強く示唆した。
2.PNH型細胞株とその野生株から1%、0.1%のPNH型細胞浮遊液を作成し、アエロリジンによるGPI-アンカー蛋白(GPI-AP)陰性細胞の濃縮を試みた結果、それぞれ55%、27%に濃縮できた。さらに酵素処理とhetero-duplex形成を組み合わせたEMDアッセイ法によりこれらでPIG-A変異を検出することができた。
3.PNHの臨床所見を欠き、さらに通常の蛍光抗体法ではGPI-AP陰性細胞の検出されない再生不良性貧血、骨髄異形性症候群39例について高感度CD59アッセイを試み、約3割にCD59陰性赤血球の増加を認めた。
4.PIG-A蛋白はGPIアンカー生合成の第1段階で他の4種の蛋白と複合体を形成してGlcNAc転移酵素活性を示す。PNH患者で見つかったミスセンス変異を有する21種の変異PIG-Aを作成し、PIG-A欠損B細胞株に導入し、変異PIG-A蛋白の転移酵素活性を測定した結果、それぞれ対応する症例のGPI-APの発現とほぼ相関した。変異PIG-A蛋白とPIG-G、-H、GPI1との結合をしらべた結果、4種の変異蛋白で後者との結合に異常を認めた。
5.レトロウイルスベクターにPIG-A遺伝子とマーカー遺伝子(NGFR)を組み込みコンストラクト(MPIN)を作成し、種々のPNH型血球に導入しGPI-AP発現回復効果を検討した。MPINは種々のPNH型細胞株、造血前駆細胞に効率よく導入され、GPI-APの発現回復が確認された。さらにMPINは健常人から得たCD34+造血幹細胞にも導入できた。
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