| 研究課題/領域番号 |
12671012
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| 研究機関 | 近畿大学 |
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研究代表者 |
金丸 昭久 近畿大学, 医学部, 教授 (70068534)
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| 研究分担者 |
嶋田 高広 近畿大学, 医学部・附属病院, 助手 (90319674)
松田 光弘 近畿大学, 医学部, 講師 (90258004)
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| キーワード | 発作性夜間血色素尿症 / PNHクローン / cDNAサブトラクション / 増殖優位性獲得 / クローニング / PIG-A変異細胞 / SMART-PCR法 |
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| 研究概要 |
発作性夜間血色素尿症(PNH)ではPIG-A遺伝子に変異があることが知られているが最近健常人の好中球にもPIG-A変異細胞が一部存在することが報告され、PIG-A遺伝子の変異に加えPNHクローンの増殖優位性獲得がその病態成立には必須であることがわかってきた。本研究の目的はPNH患者のPNHクローンに発現し、健常人PIG-A変異細胞には発現していないPNHクローン特異的遺伝子群をクローニングすることにより、PNHクローンの増殖優位性獲得に関与する遺伝子群の解明を行うことにある。
健常人のCD59^-細胞分画をフローサイトメーターによりソーティングを試みたがポピュレーションが非常に少なく、cDNAサブトラクションのために必要な量のtotal-RNAを採取することは困難であった。方針を変更し前段階の実験としてPNH患者末梢血中のCD59^-クローンと健常人のCD59^+クローン間のcDNAサブトラクションを行うことにした。あるPNH患者より採取した好中球からマグネットビーズと抗CD59抗体を用いてCD59^+分画とCD59^-分画の分離を行ったところCD59^-分画≧93%の精製が可能であった。こうして得られたPNH患者好中球のCD59^-分画と健常人好中球のCD59^+分画からtotal-RNAを抽出し、Chenchikらが開発したSMART-PCR法を用いて、それぞれのtotal-RNAからcDNAを合成し、Diatchenkoらのプロトコールに従いsuppression subtractive hybridizationを行った。PNH患者12例と健常人10例より末梢血を採取し、単核球と好中球の分離後total-RNAを抽出した。現在サブトラクションで得られた候補遺伝子断片が実際にPNH患者に特異的か否か半定量的RT-PCRを用いて確認中である。
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