| 研究概要 |
Dent病や特発性尿細管性蛋白尿症については既に多くのClC-5チャネル遺伝子の変異が報告されているが、遺伝子変異と機能障害の関連性について分子レベルの機構は未だ不明である。そこで、ClC-5のソーティング分子機構と遺伝子変異の関連性を明らかにするために、ClC-5の膜貫通部位(TMD)5-6間の細胞内ループにミスセンス変異を呈し、強制発現系で機能障害が確認された2症例(S270R, R280P)を対象に解析した。野生型と人為的に作製した2つの変異型を発現ベクターへ挿入、Lipofection法を用いて哺乳類培養細胞CHO-K1へ形質導入し安定的発現系を樹立した。ノーザンブロットおよびウェスタンブロット法で核酸と蛋白レベルでの発現を確認し、発現蛋白の細胞内局在について細胞内小器官と小胞のマーカーを指標に二重免疫染色法で解析した。変異導入培養細胞で2つの変異型チャネルは、野生型と同様に最終標的部位、細胞内小胞、までソーティングされ、核酸と蛋白レベルでの発現に相違はなかった。TMD5-6間に存在する2つの突然変異はClC-5のソーティングではなく、標的部位におけるアセンブリングに障害をきたす可能性が示唆された。さらに、TMD5-6ループが生理的にチャネルの機能発現に重要な部位であると考えられた。
ClCクロライドチャネルファミリーで同じサブファミリーに属す、ClC-3とClC-5チャネルが共に腎臓の集合尿細管の間在細胞に発現することに着目し、間在細胞のサブタイプでの局在の相違について明らかにした。腎臓におけるClC-3/ClC-5の局在を、H^--ATPase、Cl/HCO_3交換輸送体(AE-1)およびAQP2と多重染色を行い、免疫粗織学的に解析した。ClC-5が、管腔側膜にH^--ATPase(+)で、基底側膜にAE-1(+)のtypeA間在細胞に局在するのに対して、ClC-3は基底側膜にAE-1(-)で管腔側膜にH^--ATPase(+)のtypeC間在細胞に発現を認めた。相同性の高いClC-3とClC-5クロライドチャネルが、サブタイプレベルで異なる発現局在を示したことから、これらのチャネルが個々に特異的な生理学的作用を示す可能性が示唆される。
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