|
1.細胞培養
実験に供する尿細管細胞としてOK細胞(腎近位尿細管由来株化細胞)を選択した。実験直前まで10%仔牛血清添加DMEMで培養し、実験直前に無血清培地(インスリン、トランスフェリン、セレニウム添加)に変更した。
2.N-acetyl-β-glucuronidase(NAG)分泌に及ぼす影響
培地に添加する蛋白としてアルブミン、ガンマグロブリンで比較したがモル濃度では同等の効果であった。アルブミンについてはウシ、ヒト、ラットによる種差の影響も検討したが有意差はなかった。0.1〜10mg/mlの範囲で用量依存性が、6〜48時間の範囲で時間依存性が認められた。
3.ノーザンブロット
TGF-β1発現はtotal RNAではあきらかな基礎発現を認めず、5μgのpoly A+ RNAでバンドが描出された。牛アルブミンによって用量依存性に、時間依存性に発現増加がみられた。
4.培地中TGF-β1のbioassay
CCL64細胞を用いて、ペプチドとしてのTGF-β1の分泌を調べた。TGF-β1中和抗体の同時添加により特異性は確認できた。active formとlatent formの割合を1N塩酸添加による活性の差で調べたところ、ほとんどがlatent formであった。
5.細胞極性の実験
OK細胞をミリポアのfilter cupに培養した。刷子縁膜側と基底膜側の極性を保ったまま培養することが可能であり、confluent monolayerを形成した。この条件下で管腔側に添加したアルブミンによってTGF-β1蛋白はlatent formのまま管腔側に数倍多く分泌されることを見いだした。
|
