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最終年度は、ノックアウトマウス作製のためのターゲッティングベクターの構築と全長クローンを幾つかの発現ベクターに挿入た。
従来の科研費期間中により作製していた、最も表現型発現が確実と考えられるexon1から2にかけて欠失させたinv遺伝子によりターゲッティングベクターを構築した。コンストラクト作製の際にEGFPもしくはlacZ遺伝子を連結させ構築し、発現の段階で発色もしくはX galによる判別が可能として、キメラマウスなど含めて部位や時間的変化を観察できるようにした。相同組み換え体同定のためのサザン解析用のプローブおよびPCRプライマーをこれまでの助成期間で作製してあるため、実際に有効かどうかを判定。各プローブ、プライマーとも機能した。
ES細胞の培養、管理から遺伝子導入などの実際の工程では、筑波大学生命科学動物資源センター資源開発分野高橋智教授の指導を受け実行した。
表現型の相違が生じることを想定して、幾つかのターゲッティングベクターを構築したが、胆道閉鎖がコンスタントに発現する構築は疾患モデルの成立と考えられる。基本的にankyrin repeat部と3'側のinv遺伝子に特異性の高い部分の二カ所を中心とした遺伝子のmodulationを行いベクターを作製した。
また、細胞内局在を同定するためGreen fluorescence protein(GFP)を接続した遺伝子の作製と細胞内導入の予備実験を行った。inv遺伝子のサイズは大きくないため、発現ベクターをmammalian cellに遺伝子導入を行い、細胞形態の変化、膜蛋白、主としてNa/K ATPaseなどの酵素活性、遺伝子発現profileの変化を観察した。
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